Charakterisierung des entzündungshemmenden Lactobacillus reuteri BM36301 und seines probiotischen Nutzens bei gealterten Mäusen

Charakterisierung probiotischer Milchsäurebakterien

Wir isolieren seit Jahren Milchsäurebakterien (LAB) aus verschiedenen Quellen, darunter Menschen, Tiere, Pflanzen und Lebensmittelprodukte. Diese Sammlungen von Benebios Microorganisms (BM) umfassen mehr als 500 Stämme, deren probiotisches Potenzial bereits bei den ersten Untersuchungen festgestellt wurde. In dieser Studie wählten wir vier menschliche Kommensalenstämme aus Fäkalproben aus und untersuchten sie im Detail (Tabelle 1). Bei den speziell untersuchten Stämmen handelt es sich um zwei Lactobacillus reuteri-Stämme (BM36301 und BM36304), einen L. gasseri-Stamm (BM33601) und einen Bifidobacterium animalis subsp. lactis-Stamm (BM10307).

Wir untersuchten die Bakterien im Hinblick auf ihre allgemeine Qualifikation als Probiotika (Tabelle 1). Zunächst zeigten diese BM-Stämme eine Resistenz gegen Säuren (pH 2,5) und Gallensalze (0,3 %), wobei die Überlebensrate nach 1-stündiger Behandlung bei 37 °C zwischen 43 % und 98,5 % lag, was recht hohe Werte sind. Als nächstes testeten wir die antimikrobiellen Aktivitäten gegen Darmbakterien. Während L. gasseri BM33601 eine minimale Hemmung des Teststammes E. coli zeigte, bildeten alle anderen eine deutliche Hemmzone (0,5-3 mm Abstand vom LAB-Rand). Diese hemmenden Wirkungen werden in der Regel durch Bacteriocine, organische Säuren (Milchsäure oder Essigsäure), Wasserstoffperoxid oder Ethanol aus dem LAB verursacht. Schließlich untersuchten wir ihre Fähigkeit, sich in vitro an menschliche Darmepithelzellen (IECs) zu binden. Zu diesem Zweck kultivierten wir 15 Tage lang menschliche Darmkrebszellen (HT-29) auf Deckgläsern und brachten 1 Stunde lang lebende LAB-Kulturen auf diese auf (Methoden). Nach ausgiebigem Waschen wurden die verbliebenen Bakterienzellen durch Gram-Färbung sichtbar gemacht und unter dem Mikroskop ausgezählt. Die L. reuteri-Stämme BM36301 und BM36304 zeigten hohe Retentionswerte (5,5-7,4 Bakterien pro HT-29), während L. gasseri BM33601 mäßige (1,7 Bakterien pro HT-29) und B. animalis subsp. lactis BM10307 niedrige (0,3 Bakterien pro HT-29) Werte aufwiesen. Eine stärkere Adhäsion von LAB an IECs ist besonders wichtig, da sie lange genug an der Darmschleimhaut verbleiben müssen, um ihre Wirkung auf den Wirt entfalten zu können. Aus diesen Primärexperimenten ging hervor, dass die beiden L. reuteri-Stämme ein höheres Potenzial als hochwertige Probiotika aufweisen.

Regulierung der TNF-α-Produktion durch Milchsäurebakterien in vitro

Wir wollten LAB auf ihr Potenzial zur Unterdrückung von Darmentzündungen untersuchen. Zu diesem Zweck adaptierten wir ein In-vitro-Gewebekultursystem, in dem menschliche myeloische Zellen (THP-1) bei Aktivierung ihrer Toll-like-Rezeptoren (TLR) durch bakterielles Lipopolysaccharid (LPS) TNF-α absondern. Zunächst überprüften wir, dass THP-1-Zellen (5 × 104 in 1 ml Kultur), die 3,5 Stunden lang mit einer LPS-Dosis von 150 ng/ml behandelt wurden, in der Regel 200-300 pg/ml TNF-α produzieren (Abb. 1a, Spuren 1 und 2). Anschließend sammelten wir die Überstände der 24 Stunden lang gewachsenen Bakterienkulturen, trockneten sie im Vakuum und stellten das konditionierte Medium (CM) wieder her (Methoden). Dieses CM enthält komplexe Aktivitäten zur Unterdrückung und Induktion von TNF-α, je nach LAB und Kulturbedingungen. In der Tat beobachteten wir eine geringe Produktion von TNF-α durch die CMs von BM36304 und BM36301 ohne LPS, aber diese Menge betrug weniger als 20 % der LPS-stimulierten Induktion (Daten nicht gezeigt). Schließlich fügten wir jedes CM bis zu 5 % der THP-1-Kultur (v/v) in Gegenwart von LPS zu (Abb. 1a, Spuren 3-6). Die TNF-α-Produktion mit LPS (208 ± 49 pg/ml, Spur 2) wurde mit dem CM von L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, Spur 3) auf 40 % und mit dem CM von B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, Spur 6) auf 52 % unterdrückt. Für unser Screening betrachteten wir eine Unterdrückung der TNF-α-Expression von nahezu oder weniger als 50 % durch die LPS-Behandlung als entzündungshemmend. Die CMs von L. reuteri BM36304 und L. gasseri BM33601 waren jedoch nicht in der Lage, die TNF-α-Produktion bis zu diesem Punkt zu unterdrücken. Wir verifizierten diese inerte Aktivität, indem wir diese CMs unter verschiedenen Kulturbedingungen herstellten (Daten nicht gezeigt).

Als nächstes untersuchten wir die TNF-α-Induktionskapazität der Bakterienzellen selbst, da zelluläre Komponenten der grampositiven Bakterien Entzündungsreaktionen induzieren können. Zu diesem Zweck züchteten wir die Bakterien bis zur exponentiellen Phase (16 h), ernteten und wuschen sie und fügten diese lebenden Bakterienzellen im Überschuss (250-fache Zellzahl) der THP-1-Kultur zu. Die Stoffwechselaktivitäten der Bakterienzellen wurden durch die Zugabe von Antibiotika in das THP-1-Medium auf ein Minimum reduziert. Nach 6 Stunden Inkubation wurde das sezernierte TNF-α quantitativ gemessen (Abb. 1b). Obwohl alle vier LAB-Zellen TNF-α induzierten, produzierte BM36301 eine deutlich geringere Menge (609 pg/ml) als die anderen: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) und BM10307 (7141 pg/ml). Während dieser 6-stündigen Co-Inkubation beobachteten wir, dass THP-1-Zellen je nach verwendetem LAB einen unterschiedlichen Zelltod erlitten (Additional file 1). Vor allem BM36301, der niedrigste TNF-α-Induktor, verursachte das geringste Ausmaß an THP-1-Tod (9,7 %), während die anderen TNF-α-induzierenden Stämme deutlich mehr Tod verursachten (24-38 %). Daher ist es nicht der Fall, dass BM36301 aufgrund des Verlusts der THP-1-Lebensfähigkeit per se eine niedrige TNF-α-Konzentration induziert. Für unser Screening betrachteten wir LAB mit einer aktiven TNF-α-Produktion von mehr als 1000 pg/ml als pro-inflammatorisch.

Zusammenfassend wurden die in vitro immunmodulierenden Aktivitäten als anti-inflammatorisch mit dem suppressiven CM (BM36301 und BM10307) und pro-inflammatorisch mit den induktiven Lebendzellen (BM36304, BM33601 und BM10307) eingestuft. Da BM10307 beide Aktivitäten zeigte, ordneten wir ihm eine Doppelfunktion zu (Abb. 1c). Interessant war, dass die beiden L. reuteri-Stämme unterschiedliche Aktivitäten zeigten. Beim anfänglichen Screening unseres breiten Spektrums an BM-Sammlungen erwiesen sich die entzündungshemmenden Stämme als eher selten, mit einer Entdeckungsrate von weniger als 5 % (Daten nicht gezeigt). Auch einige Stämme zeigten keine der beiden Aktivitäten und fielen somit in die Kategorie „neutral“ (Daten nicht gezeigt).

Suppressive Moleküle in der BM sind stabil gegen Hitze und Trypsin

Da die BM von LAB aus verschiedenen bakteriellen Metaboliten sowie zellulären Komponenten besteht, wollten wir die entzündungshemmende Natur der BM besser verstehen. Die Expression von TNF-α verringerte sich quantitativ mit steigender Konzentration des CM von L. reuteri BM36301 (Abb. 2a) und B. animalis subsp. lactis BM10307 (Abb. 2b). Interessanterweise induzierte eine geringere Menge CM aus BM36301 (0,5× Input oder 2,5 % v/v) tatsächlich weiter TNF-α, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass dieses CM in gewissem Maße TNF-α-induzierende Stoffe enthält (Abb. 2a, Spuren 2 und 3). Dies deutet darauf hin, dass die entzündungshemmenden Stoffe quantitativ additiv sind und dass die entsprechenden Rezeptoren auf der THP-1-Zelloberfläche reichlich vorhanden sind, so dass sie leicht auf eine zunehmende CM-Behandlung reagieren. Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die CM trotz ihrer komplexen Natur aktive Metaboliten enthalten, die für die Unterdrückung von TNF-α verantwortlich sind.

Wir untersuchten außerdem die physikochemischen Eigenschaften der entzündungshemmenden Stoffe in den CMs. Es zeigte sich, dass das 10-minütige Kochen der CMs der einzelnen Stämme ihre TNF-α-hemmenden Funktionen im Vergleich zu nativen CMs nicht veränderte (Abb. 2c, Spuren 3 und 4). Auch die Behandlung mit Trypsin hatte keinen Einfluss auf ihre Aktivitäten (Abb. 2c, Spur 5). Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass die wichtigsten hemmenden Faktoren in diesen CMs weder Proteine noch hitzeempfindliche Moleküle sind.

Regulierung von TNF-α bei Mäusen mit probiotischen Bakterien

Die letzte Frage in Bezug auf die in vitro TNF-α-Regulierung auf der Grundlage unseres LAB-Screenings war, wie relevant sie für die in vivo-Anwendungen sein würde. Wir versuchten, diese Frage direkt zu beantworten, indem wir die ausgewählten L. reuteri-Stämme in einem Mausmodellsystem anwendeten. Wir bereiteten 20 Wochen alte C57BL/6-Inzuchtmäuse mit 6 männlichen und 8 weiblichen Tieren pro Gruppe vor. Dann wurde über einen Zeitraum von 20 Wochen eine Gruppe mit dem entzündungshemmenden BM36301, eine andere Gruppe mit dem entzündungsfördernden BM36304 und die Kontrollgruppe mit Traubenzucker behandelt (Methoden). Um die Belastung der Tiere so gering wie möglich zu halten, wurden die LAB-Kulturen über das Trinkwasser verabreicht, um die tägliche Aufnahmemenge von 1 × 106 Bakterien pro Maus zu erreichen. Wir boten auch eine Standarddiät an, so dass der Alterungsprozess während des Zeitraums natürlich verlief. Am Ende der 20-wöchigen Inkubationszeit (Gesamtalter 40 Wochen) wurden die Mäuse euthanasiert und das Blut für die Serumaufbereitung entnommen, um Zytokine und Testosteron mit quantitativen ELISA-Methoden zu messen. Bei der Nekropsie fanden wir keine groben morphologischen Anomalien.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir mit dem entzündungshemmenden BM36301 eine Verringerung des TNF-α im Serum beobachteten, wobei die Wirkung bei weiblichen Tieren stärker ausgeprägt war. Das proinflammatorische BM36304 führte zu einem Anstieg von TNF-α bei Männern, aber nicht bei Frauen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass unser In-vitro-Screening für die In-vivo-Erhaltung von TNF-α in diesen Mausversuchen von Bedeutung ist.

L. reuteri BM36301 sorgte bei männlichen Mäusen für eine verringerte Körpergewichtszunahme und einen hohen Testosteronspiegel

Das Altern ist die Ursache für viele Gesundheitsprobleme beim Menschen, darunter Diabetes und Fettleibigkeit. Um solche Alterungsprobleme im Tiermodell zu verstärken, werden häufig fettreiche Diäten eingesetzt. Die Interpretation dieser beschleunigten Experimente kann jedoch kompliziert sein, da die Alterung beim Menschen nicht durch eine absichtlich fettreiche Ernährung ausgelöst werden sollte. Wir haben alle Mäuse mit einer Standarddiät gezüchtet, so dass ihr Alterungsprozess möglichst natürlich ablaufen konnte. Während des 20-wöchigen Versuchszeitraums, beginnend mit dem Alter von 20 Wochen, nahmen die Männchen der Kontrollgruppe etwa 8 g (7,83 ± 1,2 g) und die Weibchen der Kontrollgruppe etwa 5 g (4,8 ± 0,94 g) zu. Bemerkenswerterweise war die Gewichtszunahme bei den mit dem entzündungshemmenden BM36301 gefütterten Männchen signifikant niedriger als bei der Kontrollgruppe (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040), und zwar um 36 % (Abb. 4a, Spuren 1 und 2). Die Gewichtszunahme der mit BM36304 behandelten Männchen (7,53 ± 0,74 g) unterschied sich jedoch nicht signifikant von der Kontrollgruppe (p = 0,67). Die Gewichtszunahmen der weiblichen Gruppen unterschieden sich statistisch nicht voneinander.

Ein weiterer signifikanter Unterschied war der Serum-Insulinspiegel von BM36304-behandelten Männchen (Abb. 4b). Während die männliche Kontrollgruppe 3,18 ± 0,65 ng/ml Insulin aufwies, zeigte die mit BM36304 gefütterte männliche Gruppe 4,91 ± 0,63 ng/ml Insulin (p = 0,027). In Übereinstimmung mit der Feststellung, dass sich die Gewichtszunahme dieser Gruppe nicht wesentlich von der der Kontrollgruppe unterschied (Abb. 4a), konnten wir bei den mit BM36304 behandelten Männchen jedoch keine ausgeprägtere Ansammlung von Bauchfett beobachten (Daten nicht gezeigt). Im Alter von 40 Wochen hat der Insulinspike bei den Mäusen möglicherweise noch keinen klinisch sichtbaren Diabetes verursacht, aber die Krankheit könnte sich bei einem höheren Alter der Mäuse stärker ausgeprägt haben. Die Insulinschwankungen zwischen den weiblichen Gruppen unterschieden sich nicht signifikant voneinander.

Schließlich konzentrierten wir uns auf den Testosteronspiegel der Männchen. Wie in Abb. 4c gezeigt, behielten die mit entzündungshemmendem BM36301 gefütterten Männchen signifikant höhere Serumtestosteronwerte (5,18 ± 0,87 ng/ml) als die Kontrollgruppe (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Die mit BM36304 behandelte Gruppe unterschied sich jedoch statistisch nicht von der Kontrollgruppe (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07). Um die Testosteron-Ergebnisse besser zu verstehen, untersuchten wir die Hoden der einzelnen Mäuse. Das Gewicht der gepaarten Hoden der mit BM36301 gefütterten Männchen betrug 0,579 ± 0,075 g und war damit 10 % schwerer als das der Kontrollmäuse (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). In Anbetracht der geringeren Gewichtszunahme in der BM36301-Gruppe (Abb. 4a) ist dieser Größenunterschied der Hoden noch deutlicher; das Verhältnis von Hodengewicht zu Körpergewichtszunahme (TW/WG) der Kontrollgruppe betrug nur 67 % desjenigen der BM36301-Gruppe. Wir konnten jedoch keine mikroskopischen Unterschiede der Hodengewebe, wie z. B. den Durchmesser der Hodenkanälchen, zwischen diesen beiden Gruppen feststellen (156,03 ± 6,65 μm der Kontrollgruppe gegenüber 153,95 ± 18,66 μm der mit BM36301 behandelten Männchen, p = 0,51). Wir haben keine anderen Studien durchgeführt, wie z. B. den Vergleich der Spermatogenese oder der Leydig-Zellfläche.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das entzündungshemmende BM36301 den Männern half, eine geringere Gewichtszunahme mit größeren Hoden und mehr Testosteron im Alter zu erhalten. Es wird angenommen, dass die verringerte Testosteronproduktion bei älteren Männern mit altersabhängigen Läsionen in den Hoden zusammenhängt, vermutlich als Folge eines entzündlichen Insults. Das entzündungsfördernde BM36304 löste einen Anstieg des Insulinspiegels aus, allerdings ohne Veränderungen der Gewichtszunahme oder des Testosteronspiegels bei den Männern. Bemerkenswerterweise hatte keiner dieser Bakterienstämme einen bedeutenden Einfluss auf diese Körpermaße bei weiblichen Mäusen.

Gesunde weibliche Haut durch das entzündungshemmende BM36301

Ein interessantes Merkmal bestimmter Probiotika ist, dass sie die Hautgesundheit auf eine Weise fördern können, die von der Immunregulation abhängt. Da BM36301 in vitro und in vivo auch entzündungshemmende Wirkungen zeigte, stellten wir uns die Frage, ob dieser Stamm solche gesundheitlichen Vorteile für die Haut bewirken kann. In der 18. Behandlungswoche rasierten wir bei 2 Mäusen aus jeder Gruppe einen Bereich und untersuchten sie nach einer Woche. Interessanterweise wuchsen bei den mit BM36301 gefütterten weiblichen Mäusen die Haare an der rasierten Stelle schneller nach, wenn auch nicht vollständig (Abb. 5a). Im Gegensatz dazu wiesen die Kontroll- oder BM36304-Gruppen keine so schnelle Erholung auf. Keines der behandelten männlichen Tiere wuchs deutlich schneller nach als die Kontrollgruppe, was darauf hindeutet, dass dieses beschleunigte Haarwachstum nur bei weiblichen Tieren zu beobachten ist. Ein weiterer Maßstab für die Beurteilung der Hautgesundheit ist der Glanz des Fells. Wir konnten jedoch keine aussagekräftigen Unterschiede zwischen den einzelnen Gruppen durch sensorische Messungen oder Messungen mit dem Belichtungsmesser feststellen, was hauptsächlich auf den relativ glänzenden Fellzustand der Kontrollen zurückzuführen war (Daten nicht gezeigt).

Wir bewerteten die Hautgesundheit weiter, indem wir Hautquerschnitte nach Färbung mit Hämatoxylin und Eosin unter dem Mikroskop untersuchten. Wie in Abb. 5b und c gezeigt, wiesen die mit BM36301 behandelten weiblichen Mäuse eine höhere Anzahl subkutaner Haarfollikel (HF) auf als die weiblichen Kontrollmäuse. Die Anzahl der HF pro mikroskopischer Ansicht bei 400-facher Auflösung betrug 3,50 ± 0,52 für die weibliche Kontrollgruppe, während die Anzahl bei den mit BM36301 gefütterten Weibchen 4,80 ± 0,61 betrug, was einen bedeutenden Unterschied darstellt (p = 0,023). Die mit BM36304 behandelten Weibchen wiesen jedoch nur eine geringe Veränderung auf (4,15 ± 1,73, p = 0,55 gegenüber der Kontrollgruppe). Bei einer detaillierteren Analyse der Haarfollikel stellten wir fest, dass die mit BM36301 gefütterten Weibchen geringfügig aktivere Stadien des Haarzyklus aufwiesen als die Kontrollgruppe (Anagen + Katagen: Telogen 81:19 bei der Kontrollgruppe vs. 95:5 bei den mit BM36301 gefütterten Weibchen). Die HF-Zahlen der männlichen Gruppen unterschieden sich dagegen nicht wesentlich voneinander (Abb. 5b). Schließlich untersuchten wir auch die Hautdicke, gemessen als die Tiefe von der Epidermis bis zum Panniculus carnosus (Abb. 5c, Zusatzdatei 1). Wir konnten keinen großen Unterschied in der Tiefe zwischen der Kontrollgruppe und den mit BM36301 behandelten Weibchen feststellen. Allerdings erwiesen sich die Hautschichten der mit BM36301 gefütterten Mäuse als geringfügig tiefer als die der Kontrollmäuse, und das Fettgewebe der mit BM36301 behandelten Mäuse war flacher als das der Kontrollmäuse. Die meisten subkutanen HF befanden sich in der Dermis.

Insgesamt deuten diese Beobachtungen darauf hin, dass die Behandlung mit dem entzündungshemmenden BM36301 eine gesündere Haut förderte, was durch das Nachwachsen der Haare und die Anzahl der HF bei den weiblichen Tieren belegt wird. Die mikroskopischen Unterschiede zwischen den Hautproben der Kontrollgruppe und der BM36301-Gruppe waren jedoch eher marginal. Diese Vorteile für die Hautgesundheit wurden bei Männern nicht beobachtet. Auch das entzündungsfördernde BM36304 verursachte zum Zeitpunkt der Versuche keine nachteiligen Auswirkungen auf die Haut.