Nuklease, jedes Enzym, das Nukleinsäuren spaltet. Nukleasen, die zur Enzymklasse der Hydrolasen gehören, sind in der Regel spezifisch in ihrer Wirkung: Ribonukleasen wirken nur auf Ribonukleinsäuren (RNA) und Desoxyribonukleasen nur auf Desoxyribonukleinsäuren (DNA). Einige Enzyme mit allgemeiner Wirkung (z. B. Phosphoesterasen, die Phosphorsäureester hydrolysieren) können als Nukleasen bezeichnet werden, weil Nukleinsäuren für ihre Wirkung empfänglich sind. Nukleasen kommen sowohl bei Tieren als auch bei Pflanzen vor.
Restriktionsenzyme sind Nukleasen, die nur diejenigen DNA-Moleküle spalten, in denen sie bestimmte Untereinheiten erkennen. Einige spalten das Ziel-DNA-Molekül an zufälligen Stellen (Typ I), andere wiederum spalten das Molekül nur an der Erkennungsstelle (Typ II) oder in einem festen Abstand zur Erkennungsstelle (Typ III). Restriktionsenzyme des Typs II und III sind leistungsfähige Werkzeuge zur Aufklärung der Basensequenz in DNA-Molekülen. Sie spielen eine grundlegende Rolle auf dem Gebiet der rekombinanten DNA-Technologie oder der Gentechnik.