Bei der Blitzlichtfotografie tritt das Licht des Blitzes zu schnell auf, als dass sich die Pupille schließen könnte, Daher dringt ein großer Teil des sehr hellen Blitzlichts durch die Pupille in das Auge ein, wird am Augenhintergrund reflektiert und tritt durch die Pupille wieder aus. Die Kamera zeichnet dieses reflektierte Licht auf. Die Hauptursache für die rote Farbe ist die große Menge an Blut in der Aderhaut, die den Augenhintergrund ernährt und sich hinter der Netzhaut befindet. Das Blut im Netzhautkreislauf ist weitaus geringer als in der Aderhaut und spielt praktisch keine Rolle. Das Auge enthält mehrere photostabile Pigmente, die alle im kurzwelligen Bereich absorbieren und somit etwas zum Rote-Augen-Effekt beitragen. Die Linse schneidet tiefblaues und violettes Licht unter 430 nm (je nach Alter) ab, und das Makulapigment absorbiert zwischen 400 und 500 nm, aber dieses Pigment befindet sich ausschließlich in der winzigen Fovea. Das Melanin, das sich im retinalen Pigmentepithel (RPE) und in der Aderhaut befindet, zeigt eine allmählich zunehmende Absorption zu den kurzen Wellenlängen hin. Das Blut ist jedoch der Hauptfaktor für die rote Farbe, denn es ist bei langen Wellenlängen völlig transparent und beginnt bei 600 nm abrupt zu absorbieren. Die Menge des aus der Pupille austretenden roten Lichts hängt von der Melaninmenge in den Schichten hinter der Netzhaut ab. Diese Menge variiert stark von Person zu Person. Hellhäutige Menschen mit blauen Augen haben relativ wenig Melanin im Augenhintergrund und zeigen daher einen viel stärkeren Rote-Augen-Effekt als dunkelhäutige Menschen mit braunen Augen. Das Gleiche gilt für Tiere. Die Farbe der Iris selbst ist für den Rote-Augen-Effekt praktisch ohne Bedeutung. Das liegt auf der Hand, denn der Rote-Augen-Effekt tritt am deutlichsten auf, wenn dunkelhäutige Personen fotografiert werden, also mit vollständig geweiteten Pupillen. Fotografien, die mit Infrarotlicht durch Nachtsichtgeräte aufgenommen werden, zeigen immer sehr helle Pupillen, da die Pupillen im Dunkeln vollständig geweitet sind und das Infrarotlicht von keinem Augenpigment absorbiert wird.
Die Rolle des Melanins beim Rote-Augen-Effekt ist bei Tieren mit Heterochromie nachgewiesen: Nur das blaue Auge zeigt den Effekt. Bei Menschen und Tieren mit Albinismus ist der Effekt noch stärker ausgeprägt. Bei allen Formen von Albinismus kommt es zu einer abnormen Produktion und/oder Ablagerung von Melanin.
Der Rote-Augen-Effekt tritt bei Fotos von Kindern auch deshalb auf, weil sich Kinderaugen schneller an die Dunkelheit anpassen: Bei schwachem Licht erweitern sich die Pupillen eines Kindes schneller, und eine vergrößerte Pupille verstärkt den Rote-Augen-Effekt.
Bei Schauspielern auf der Bühne wird der Rote-Augen-Effekt gelegentlich von Kameraleuten beobachtet, die fast zufällig in der Nähe eines sehr hellen Lichts und etwas entfernt von den Schauspielern stehen. Der Effekt ist für den Rest des Publikums nicht sichtbar, da er von dem sehr kleinen Winkel zwischen dem Verfolger und dem Licht abhängt.