Tetracyclin-induzierbare Systeme wurden in Hefe ausgiebig verwendet, um die Kontrolle der Gentranskription in einzelnen Zellen zu untersuchen15,16,17,18,19,20,21,22. Um rtTA in diesem Zusammenhang zu nutzen, haben wir zwei starke Doxycyclin-responsive Promotoren mit entweder drei (PTET3) oder vier (PTET4) rtTA-Bindungsstellen geschaffen und die optimierte rtTA-M2-Variante7 verwendet, um die Expression von grün fluoreszierendem Hefeprotein (yeGFP)23 von diesen Promotoren aus zu kontrollieren (Abb. 1a). Die rtTA/PTET-yeGFP-Expressionskassette wurde in einer einzigen Kopie in das Hefegenom integriert. Die M2-Variante ist identisch mit der Variante, die in den Tet-ON-Advanced-Expressionssystemen von ClonTech zu finden ist.
rtTA-M2 hat eine signifikante Aktivität in Abwesenheit von Doxycyclin-Induktion.
(a) Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus, bei dem rtTA-M2 von den konstitutiven PMYO2- oder PTDH3-Promotoren und yeGFP von einem tet-responsiven Promotor exprimiert wird. (b) Doxycyclin-Dosis-abhängige Aktivierung von rtTA-M2, das entweder von PMYO2 oder PTDH3 exprimiert wird (Mittelwert +/- s.e.m. von drei technischen Replikaten). AutoFL ist Wildtyp BY4742 Hefezellen. (c) Verteilungen der Einzelzellfluoreszenz von Zellen, die das PMYO2-rtTA-System tragen, bei unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentrationen. Die zunehmend dunkleren Grautöne entsprechen jeweils 0,25, 1, 5 und 100 μg/ml Doxycyclin. AutoFL ist Wildtyp BY4742-Hefezellen (d) Zusammengeführte Hellfeld-Fluoreszenzbilder von Wildtyp BY4742-Hefezellen oder nicht induzierten Zellen, die das PMYO2-rtTA-System tragen.
Das Problem der undichten Zielgen-Transkription ist besonders gravierend, wenn rtTA in hohen Konzentrationen exprimiert wird. Dies wird in Abb. 1b veranschaulicht, die PTET3-Doxycyclin-Dosis-Wirkungs-Kurven zeigt, wenn rtTA-M2 vom starken PTDH3-Promotor exprimiert wird. Die Fluoreszenz war sehr hoch, wenn die Zellen sättigenden Mengen von Doxycyclin ausgesetzt waren. Aufgrund der undichten Transkription des PTET3-Promotors war der dynamische Bereich des Systems jedoch eher gering, wobei die maximale Expression bei voller Induktion etwa 17-mal größer war als in Abwesenheit von Doxycyclin.
In Übereinstimmung mit einem Modell, bei dem der Transaktivator in seinem nicht induzierten Zustand ein erhebliches Aktivierungspotenzial besitzt, verringerte die Expression von rtTA-M2 aus dem schwachen PMYO2-Promotor die Fluoreszenz in Abwesenheit von Doxycyclin erheblich. Obwohl bei diesem System keine vollständige Sättigung beobachtet wurde, führte die Verringerung der undichten Expression zu einer drastischen Verbesserung des dynamischen Bereichs, und die Induktion mit Doxycyclin führte zu einer ~200-fachen Steigerung der Fluoreszenz. Trotz dieser Verbesserung zeigten sowohl die Daten der Durchflusszytometrie (Abb. 1c) als auch die Daten der Fluoreszenzmikroskopie (Abb. 1d), dass uninduziertes rtTA-M2 eine signifikante Reportergenexpression verursacht, selbst wenn der Transaktivator von einem schwachen Promotor exprimiert wird.
Beim anfänglichen Testen von zwölf Klonen, die das PTDH3-rtTA-M2-System trugen, entdeckten wir zufällig, dass einer von ihnen in Abwesenheit von Doxycyclin eine unerwartet niedrige Fluoreszenz, bei voller Induktion jedoch eine fast normale Fluoreszenz zeigte (Abb. 2a). Bei der anschließenden Sequenzierung wurde eine einzelne Nukleotidmutation (Guanin zu Thymin) identifiziert, die ein Glycin (GGG) zu einem Valin (GTG) an Rest 72 im Transaktivatorprotein verändert. Western-Blot-Analysen zeigten, dass diese Substitution keinen Einfluss auf die Proteinhäufigkeit hat (Abb. 2a, Insert, siehe ergänzende Abb. S1 für Details), und die Rekonstruktion des Expressionssystems bestätigte, dass die einzelne Guanin-zu-Thymin-Mutation für die Veränderungen in der Doxycyclin-Dosisantwort verantwortlich ist (Daten nicht gezeigt).
Die Mutation von Glycin 72 in rtTA-M2 verringert die Basalaktivität auf ein nicht nachweisbares Niveau.
(a) Doxycyclin-Dosis-abhängige Aktivierung von rtTA-M2-Varianten, die von PTDH3 exprimiert werden (Mittelwert +/- s.e.m. von drei technischen Replikaten). AutoFL ist Wildtyp BY4742 Hefezellen. Inset, ein Western Blot (Ausschnitt), der die Proteinhäufigkeiten von rtTA-M2 und der G72V-Mutante vergleicht. Alle Proben wurden unter identischen Versuchsbedingungen hergestellt und durchgeführt. (b) Verteilungen der Einzelzellfluoreszenz von Zellen, die das PTDH3-rtTA(G72V)-System tragen, bei unterschiedlichen Doxycyclin-Konzentrationen. AutoFL ist Wildtyp BY4742 Hefezellen. Zunehmend dunklere Grautöne entsprechen jeweils 1, 2,5, 5 und 100 μg/mL Doxycyclin. (c) Zusammengefasste Hellfeld-Fluoreszenzbilder von nicht induzierten Zellen, die die Systeme PTDH3-rtTA-M2 oder PTDH3-rtTA(G72V) tragen. (d) Cartoon-Darstellung des TetR-Dimers, bei der jedes Protomer unterschiedlich gefärbt ist (gelb und türkis). Die Sekundärstruktur ist markiert und G72 ist als Kugel dargestellt.
Das PTDH3-rtTA-M2(G72V)-System hat einen bemerkenswerten dynamischen Bereich und zeigte einen ~500-fachen Anstieg der Fluoreszenzintensität, wenn die Zellen mit hohem Doxycyclingehalt induziert wurden, verglichen mit keiner Induktion (Abb. 2b). Darüber hinaus ist die durchflusszytometrisch erfasste Fluoreszenzemission nicht von der zellulären Autofluoreszenz in Abwesenheit von Doxycyclin zu unterscheiden, und die Variante bewahrt die abgestufte Induktionsantwort des ursprünglichen Transaktivators. Darüber hinaus war die Reporterexpression des nicht induzierten rtTA-M2(G72V)-Stammes durch Fluoreszenzmikroskopie nicht nachweisbar, selbst unter Geräteeinstellungen, bei denen der nicht induzierte rtTA-M2-Stamm ein starkes Sättigungssignal lieferte (Abb. 2c).
Um einen Einblick zu erhalten, wie eine einzelne Mutation einen so drastischen Einfluss auf den dynamischen Bereich von rtTA-M2(G72V) haben kann, untersuchten wir, wo sich der Rest im Kontext der dreidimensionalen Struktur des Proteins befindet. Die Struktur von rtTA-M2 oder anderen rtTA-Varianten ist noch nicht gelöst. Da jedoch 203 von 207 Aminosäuren in der TetR-Domäne von rtTA erhalten sind7, gibt die hochauflösende Struktur von TetR24 Aufschluss über die Struktur der rtTA-DNA-Bindungsdomäne. In der TetR-Struktur ist der Glycinrest 72 einer flexiblen Schleife zugeordnet, die sich zwischen den α-Helices α4 und α5 befindet, einer Region, die die Repressor-DNA-Bindungsdomäne (α1-α3) und ihre Tetracyclin-Bindungsregion (α5-α9) überbrückt24,25 (Abb. 2d). Dies deutet darauf hin, dass die Substitution, die eine unpolare Seitenkette einführt, weitreichende Konformationsänderungen auslöst, die sich letztlich auf die Aktivität des Transaktivators auswirken, vermutlich durch Versteifung seiner Tertiärstruktur.
Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir zwei weitere Varianten erstellt, bei denen der Glycinrest zu Alanin oder Prolin mutiert wurde. Diese Mutationen bewahren die unpolare Natur des Valinrestes, führen aber Seitenketten unterschiedlicher Größe ein. Wir gingen davon aus, dass die einzelne Methyl-Seitenkette von Alanin weniger wirksam bei der Verhinderung einer nicht induzierten Aktivität sein würde als die große zyklische Seitenkette von Prolin. Wir haben auch ein mit β-Estradiol induzierbares Expressionssystem26 entwickelt, um eine direkte Kontrolle der rtTA-M2-Expression zu erhalten, und den Promotor mit einer zusätzlichen TetR-Bindungsstelle, PTET4, verwendet, um die Fähigkeit von rtTA zur DNA-Bindung zu verbessern. Das Expressionssystem ist schematisch in (Abb. 3a) dargestellt. Wir bestätigten durch Western-Blot-Analyse, dass die vier rtTA-Varianten bei voller β-Estradiol-Induktion in ähnlichem Maße exprimiert werden (Abb. 3b, siehe ergänzende Abb. S2 für Details) und dass die Fluoreszenz eines Stammes, dem rtTA fehlt, eine Reporter-Expression aufweist, die von einem Wildtyp BY4742-Hefestamm nicht zu unterscheiden ist, was zeigt, dass es keine Hintergrund-Reporter-Expression von PTET4 gibt (ergänzende Abb. S3). S3).
Die unpolare Seitenkette am Rest 72 ist eine Schlüsseldeterminante der basalen Aktivität.
(a) Schematische Darstellung des Gen-Netzwerks, in dem rtTA-M2-Varianten von einem β-Estradiol-induzierbaren Promotor und yeGFP von einem tet-responsiven Promotor exprimiert werden. (b) Western Blot (Ausschnitt) zum Vergleich der Proteinhäufigkeiten aller vier rtTA-Varianten nach Induktion durch 1000 nM β-Estradiol oder ohne Induktion. Alle Proben wurden unter identischen Versuchsbedingungen hergestellt und durchgeführt. (c) Zusammengefasste Hellfeld-Fluoreszenz-Bilder aller vier rtTA-Varianten, die durch 1000 nM β-Estradiol und ohne Doxycyclin-Induktion induziert wurden. (d) Die Grundaktivität der rtTA-Varianten in Abhängigkeit von ihrem β-Estradiol-abhängigen Expressionsniveau (Mittelwert +/- s.e.m. von drei technischen Wiederholungen). Inset: Histogramme der Reporterexpression für die verschiedenen rtTA-Varianten. (e) Doxycyclin-Dosis-abhängige Aktivierung von rtTA-M2-Varianten, die ubiquitär in 1000 nM β-Estradiol exprimiert werden (Mittelwert +/- s.e.m. von drei technischen Replikaten).
Wie erwartet, zeigte die Alanin-Variante eine höhere Leck-Expression als die Valin-Variante und die Prolin-Variante hatte eine Fluoreszenz, die von der zellulären Autofluoreszenz, gemessen durch Durchflusszytometrie, nicht zu unterscheiden war. Dies geht aus Fluoreszenzmikroskopie-Bildern hervor, die mit Geräteeinstellungen erhalten wurden, bei denen der Stamm mit der ursprünglichen M2-Variante ein starkes Fluoreszenzsignal bei voller β-Estradiol-Induktion aufweist (Abb. 3c), sowie aus Fluoreszenzmessungen mittels Durchflusszytometrie bei unterschiedlicher β-Estradiol-Induktion (Abb. 3d).
Besonders bemerkenswert ist, dass die Aminosäure-Substitutionen, die die basale Reportergen-Expression signifikant reduzieren, nur minimale Auswirkungen auf die rtTA-Transkriptionsaktivierung bei voller β-Estradiol- und Doxycyclin-Induktion haben. Dies ist in Abb. 3E dargestellt, die die Dosis-Wirkungs-Kurven für die vier G72-M2-Varianten zeigt, die gemessen wurden, wenn Doxycyclin bei voller β-Estradiol-Induktion variiert wurde. Die Aminosäuresubstitutionen wirken sich jedoch auf die Doxycyclinempfindlichkeit aus. In unseren Experimenten (Abb. 3e) hatte die M2-Variante die höchste Empfindlichkeit mit einer halben maximal wirksamen Konzentration (EC50) von ~0,06 μg/mL, während die Alanin-Variante (EC50 von ~0,2 μg/mL), die Valin-Variante (EC50 von ~1,0 μg/mL) und die Prolin-Variante (EC50 von ~1.5 μg/mL) benötigten progressiv höhere Doxycyclin-Konzentrationen, um die maximale Expressionskapazität zu erreichen.
Um dem Effekt der G72-Mutation auf die Doxycyclin-Empfindlichkeit entgegenzuwirken, führten wir zusätzliche Mutationen in die TetR-Domäne ein, von denen kürzlich gezeigt wurde, dass sie die Empfindlichkeit gegenüber Doxycyclin erhöhen10,11,27. Wir untersuchten speziell die Auswirkungen der Einführung der sensitivitätssteigernden (SE) Mutationen V9I, F67S, F86Y und R171K.
Abbildung 4A,B zeigt, dass die SE-Mutationen die Doxycyclin-Empfindlichkeit der rtTA M2-Varianten SE-G72P und SE-G72A verbessern. Wenn die rtTA-Varianten in hohen Konzentrationen vom vollständig aktivierten β-Estradiol-induzierbaren Promotor (Abb. 3a) exprimiert werden, reduziert die Einführung der SE-Mutationen die Doxycyclin-EC50 von ~1,5 μg/mL auf ~0,1 μg/mL für die G72P-Variante (Abb. 4a) und von ~0,2 μg/mL auf ~0,02 μg/mL für die G72A-Variante (Abb. 4b). Dieser Effekt trat ohne nennenswerte Veränderung der Reporterexpression unter voller Doxycyclin-Induktion auf und beeinträchtigte den dynamischen Bereich der SE-G72P-Variante nicht. Interessanterweise verursachten die SE-Mutationen jedoch einen signifikanten Verlust des dynamischen Bereichs für die SE-G72A-Variante, indem sie die Reportergenexpression in Abwesenheit von Doxycyclin erhöhten.
Die Doxycyclin-Empfindlichkeit der neuen rtTA-Varianten kann durch Hinzufügen von empfindlichkeitssteigernden Mutationen verbessert werden.
(a,b) Doxycyclin-Dosis-abhängige Aktivierung von rtTA-Varianten, die ubiquitär in 1000 nM β-Estradiol exprimiert werden (Mittelwert +/- s.e.m. von drei technischen Replikaten). (c-f) Heatmaps, die die Reporterexpression (willkürliche Einheiten) als Funktion der β-Estradiol-abhängigen Transaktivator-Expression und der Doxycyclin-Induktion zeigen.
Um die Beziehung zwischen dem Niveau der rtTA-Expression, der Doxycyclin-EC50 und der Grundaktivität weiter zu erforschen, untersuchten wir die Auswirkung der gleichzeitigen Variation der β-Estradiol- und Doxycyclin-Induktion auf die Reportergen-Expression. Wir untersuchten vier verschiedene M2-Varianten: die ursprüngliche Variante, die ursprüngliche Variante mit den SE-Mutationen, die G72P-Variante und die SE-G72P-Variante.
Die zweidimensionale Dosis-Wirkungs-Oberfläche für die ursprüngliche M2-Variante enthält drei verschiedene Regionen der Reporter-Expression, die einer niedrigen, mittleren und hohen Reportergen-Expression entsprechen. Diese Regionen sind in Abb. 4c-f mit I, II und III gekennzeichnet. In der Region III ist die Reporterexpression maximal, was sowohl vom rtTA-Expressionsniveau als auch von der Höhe der Doxycyclin-Induktion abhängt. In der Region II ist die Reporterexpression relativ hoch, auch wenn die Doxycyclin-Induktion gering ist. In der Region I ist die Reporterexpression aufgrund von niedrigem β-Estradiol oder geringer Doxycyclin-Induktion niedrig.
Die SE-Mutationen allein (Abb. 4d) erhöhen die Reporterexpression in einem Teil der Region I und in der gesamten Region II drastisch. Dies bestätigt, dass diese Mutationen die Empfindlichkeit in einem engen Bereich von rtTA-Expressionsniveaus erhöhen können, aber auch eine signifikante Erhöhung der Aktivität von rtTA im nicht-induzierten Zustand verursachen. Im Gegensatz dazu reduziert die G72P-Mutation allein (Abb. 4e) die Reporterexpression in der gesamten Region II und in einem Teil der Region III drastisch. Dies bestätigt, dass die tiefgreifende Wirkung dieser Mutation auf die rtTA-Aktivität im nicht-induzierten Zustand mit einem allgemeinen Verlust der Doxycyclin-Empfindlichkeit verbunden ist.
Abbildung 4f zeigt die Wirkung der Kombination der SE- und der G72P-Mutation. Im Vergleich zur SE-Variante (Abb. 4d) wirkt das Hinzufügen der G72P-Mutation dem durch die SE-Mutationen verursachten Anstieg der Reporterexpression in der Region I entgegen und reduziert die Reporterexpression in dieser Region auf nicht nachweisbare Werte. Darüber hinaus wird im Vergleich zur G72P-Variante (Abb. 4e) durch das Hinzufügen der SE-Mutationen der Verlust der Reporterexpression in Region III fast vollständig wiederhergestellt. Mit anderen Worten: Die Sensitivität wird verbessert, ohne dass es zu einer undichten Zielgenexpression auf jedem Transaktivator-Expressionsniveau kommt.