Vergleich von Chromosomenanalyse und Chromosomen-Mikroarray-Analyse: Welchen Wert hat die Chromosomenanalyse in der heutigen Ära der Genomik-Arrays?

Chromosomenanalyse und CMA sind klinisch nützliche Diagnoseinstrumente zum Nachweis von Chromosomenanomalien im gesamten menschlichen Genom. Derzeit wird die CMA als erster Test für geistige Behinderung und angeborene Defekte empfohlen und hat die frühere Rolle der Chromosomenanalyse ersetzt. In dieser Studie haben wir die Ergebnisse der Chromosomenanalyse und der CMA in 3.710 Fällen verglichen, um den Wert der Chromosomenanalyse zu bestimmen.

Maximaler Nachweis von Mosaizismus durch eine Kombination von CMA und traditioneller zytogenetischer Analyse

Diese Studie zeigte, dass 1,2 % (43/3.710) der Patienten einen Mosaikbefund hatten. In 39 % der Fälle wurde der Mosaizismus nur durch die Chromosomenanalyse festgestellt, da entweder ein sehr geringer (<10 %) oder sehr hoher (>80 %) Prozentsatz abnormaler Zellen vorlag, während 12 % der Fälle nur durch die CMA entdeckt wurden. Die verbleibenden 49 % der Fälle wurden sowohl durch die CMA als auch durch die Chromosomenanalyse entdeckt.

Der Nachweis von Mosaizismus durch die CMA und der durch die Chromosomenanalyse unterscheiden sich aufgrund der unterschiedlichen Technologie und der analysierten Zellpopulation. Die CMA analysiert DNA, die aus allen kernhaltigen Zellen im peripheren Blut gewonnen wurde, einschließlich mehrerer Zelllinien. Im Gegensatz dazu wird die Chromosomenanalyse hauptsächlich an T-Lymphozyten durchgeführt, die durch Phytohämagglutinin stimuliert wurden. Studien haben gezeigt, dass die CMA empfindlicher sein kann, wenn abnorme Zellen nicht auf Mitogene reagieren und/oder Anomalien in T-Zellen selten oder nicht vorhanden sind, wie z. B. beim Pallister-Killian-Syndrom.5,6 Fünf Fälle von Mosaik-Trisomie, an denen die Chromosomen 8, 9, 14 und 22 beteiligt waren, wurden nur durch CMA entdeckt.

Obwohl CMA Mosaizismus in einer Größenordnung von 30 % oder mehr leicht nachweisen kann, ist es beim routinemäßigen Nachweis von Mosaizismus in einer Größenordnung von <10 % eingeschränkt.6,13,14 Andere Array-Plattformen, wie z. B. Einzelnukleotid-Polymorphismus-Arrays, sind möglicherweise besser in der Lage, Mosaizismus anhand der aus den B-Allel-Häufigkeiten gewonnenen Informationen zu erkennen.15,16 Die Chromosomenanalyse kann durch die individuelle Untersuchung einer großen Anzahl von Zellen Mosaizismus auf niedrigem Niveau nachweisen. Bei einer Standard-Chromosomenuntersuchung von 20 Zellen werden 14 % Mosaizismus mit einer Sicherheit von 95 % ausgeschlossen. Wenn eine oder zwei abnorme Metaphase-Zellen identifiziert werden, können mehr Zellen untersucht werden. Die Analyse vieler einzelner Zellen ist jedoch zeit- und arbeitsaufwändig. Wird Mosaizismus vermutet oder bestätigt, können mit FISH Hunderte von einzelnen Interphase-Zellen untersucht werden, um den Grad des Mosaizismus zu bestimmen; FISH ist relativ weniger zeitaufwendig als die Chromosomenanalyse.

Die von der CMA übersehenen Anomalien, mit Ausnahme der scheinbar balancierten Rearrangements, machen <0,2 % der Gesamtfälle in dieser Studie aus (Tabelle 2). Die meisten Fälle waren mit der CMA nicht nachweisbar, da der Anteil der abnormalen Zellen unter der Nachweisgrenze der CMA lag (<10 %). Die klinische Bedeutung des sehr geringen Mosaizismus in den Fällen 2 und 3 und des kleinen Markerchromosoms, das ausschließlich perizentromerische Wiederholungssequenzen enthält, in Fall 4 ist unklar. Die übrigen Anomalien, die von der CMA übersehen wurden, sind mit phänotypischen Anomalien verbunden. Es ist nicht klar, warum die Anomalie, die in 30 % der kultivierten Zellen in Fall 5 beobachtet wurde, von der CMA übersehen wurde, aber vermutlich ist sie darauf zurückzuführen, dass die anomalen Zellen speziell in den T-Zellen überrepräsentiert sind. Das Vorhandensein von zwei verschiedenen Zelllinien mit genomischen Zugewinnen und Verlusten, die dieselbe Region betreffen, führte zu einem genomischen Gleichgewicht für diese Region und entging so der Entdeckung durch CMA, wie in Fall 6 gezeigt.

Der Nachweis von Mosaizismus durch CMA beruht auf der Abweichung von den erwarteten logarithmischen Verhältnissen für Deletion oder Duplikation ohne Mosaizismus. Der Verdacht auf Mosaizismus muss durch eine Chromosomenanalyse an kultivierten Zellen oder eine FISH-Analyse, vorzugsweise anhand von Blutausstrichen, bestätigt werden. In 11 der hier untersuchten Fälle konnte die CMA zwar die Chromosomenanomalie nachweisen, aber nicht feststellen, dass es sich um ein Mosaik handelt, weil der Anteil normaler Zellen gering war oder ein isodizentrisches Chromosom vorlag, das zu einer segmentalen Tetrasomie führte. So wurde beispielsweise in zwei Fällen eine Erhöhung der Kopienzahl mit allen Sonden für Chromosom 18 durch die CMA festgestellt (Abbildung 2), was auf eine Trisomie 18 schließen lässt. Tatsächlich zeigte die Chromosomenanalyse, dass ein Fall in allen Zellen Trisomie 18 aufwies (Abbildung 2a), während der andere Fall in 80 % der Zellen Mosaizismus für Trisomie 18 aufwies (Abbildung 2b). Wenn zwei oder mehr abnorme Zelllinien dieselbe Region betreffen, wie im Fall in Abbildung 2c , ist eine Chromosomen- und/oder FISH-Analyse für eine korrekte Interpretation der Chromosomenanomalien unerlässlich.

Chromosomale Strukturinformationen werden durch die Chromosomenanalyse geliefert, sind aber durch die CMA nicht ersichtlich

Die CMA liefert sehr zuverlässige Informationen darüber, ob Kopienzahlgewinne und -verluste vorhanden sind, liefert aber keine Positions- oder Orientierungsinformationen. Unsere Studien haben gezeigt, dass in 18 % der abnormalen CMA-Fälle strukturelle Anomalien festgestellt wurden. Bei der Hälfte der in dieser Studie identifizierten strukturellen Rearrangements handelt es sich um unbalancierte Translokationen/Insertionen, bei einem Drittel um andere strukturelle Veränderungen wie Ringchromosomen, Markerchromosomen, Isochromosomen und isodozentrische Chromosomen, und bei den restlichen 15 % um komplexe Rearrangements. Da die meisten dieser strukturellen Aberrationen subtelomere Regionen betreffen, haben terminale Kopienzahlveränderungen eine höhere Wahrscheinlichkeit für weitere strukturelle Anomalien.17 Im Allgemeinen können sowohl mit der Chromosomenanalyse als auch mit der FISH-Analyse Translokationen, Insertionen, Isochromosomen und Marker identifiziert werden, wobei die Stärken der einzelnen Methoden unterschiedlich sind. Obwohl FISH Veränderungen aufspüren kann, die zu klein sind, um von der Chromosomenanalyse erkannt zu werden, liefert die Analyse der Chromosomenbandenmuster zusätzliche Informationen über die betroffenen Regionen. Im Falle komplexer Rearrangements kann eine kombinierte FISH- und Chromosomenanalyse erforderlich sein, um die komplexen strukturellen Veränderungen vollständig zu bestimmen. Mit dieser Ausnahme ist die FISH-Analyse nach einem anormalen Befund durch CMA in der Regel ausreichend, um Informationen über die Art der Kopienzahlveränderung zu liefern.

Einige chromosomale Rearrangements können selbst nach CMA und FISH übersehen werden. So wurde beispielsweise im Fall 9 eine interstitielle Deletion in 2q durch CMA entdeckt (Abbildung 1a). Ohne Chromosomenanalyse scheint es sich um eine einfache Deletion zu handeln, selbst nach einer bestätigenden FISH-Analyse. Die Untersuchung des Karyotyps zeigte jedoch ein abnormales Chromosom 2 mit einer Insertion eines Segments von 17q23.1q23.3 in die Bande 2p11.2. Darüber hinaus weist das Chromosom 2 mit dem eingefügten 17q-Segment auch eine perizentrische Inversion zwischen 2p12 und 2q31.1 auf. Die durch die CMA entdeckte Deletion auf 2q31.1 trat höchstwahrscheinlich am oder in der Nähe des Inversionsbruchpunkts auf dem langen Arm eines Chromosoms 2 auf. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass es sich bei Fall 9 um ein komplexes Rearrangement handelte, das eine Deletion auf 2q umfasste, die mit der CMA nachweisbar, aber mit der Chromosomenanalyse nicht sichtbar war, sowie eine Insertion und eine Inversion, die die Chromosomen 2 und 17 betraf und mit der Chromosomenanalyse, aber nicht mit der CMA nachweisbar war. In ähnlicher Weise wies Fall 10 de novo Rearrangements auf, an denen vier Chromosomen beteiligt waren, darunter eine Insertion des Segments 2q14.2q24.1 in den kurzen Arm von Chromosom 6, das ebenfalls eine parazentrische Inversion aufweist, und eine reziproke Translokation zwischen den Chromosomen 12 und 18. Kopienzahlverluste wurden durch CMA in der Nähe der Bruchpunkte in den Chromosomen 2 und 6 festgestellt (Abbildung 1b). Eine korrekte Diagnose erfordert die Kombination von CMA und Chromosomenanalyse.18

Die Identifizierung von chromosomalen strukturellen Umlagerungen ist für die genetische Beratung der Familie unerlässlich. Die durch die CMA entdeckten genomischen Ungleichgewichte könnten auf ein unausgewogenes Segregationsprodukt einer balancierten Translokation oder Insertion bei einem Elternteil zurückzuführen sein und rechtfertigen daher die dringende Empfehlung, elterliche Studien durchzuführen. Darüber hinaus bieten die chromosomalen Strukturinformationen einen Anhaltspunkt dafür, welche elterlichen Untersuchungen empfohlen werden sollten. Für die Rearrangements, die wahrscheinlich Produkte eines balancierten Rearrangements sind, sollte anstelle einer elterlichen CMA eine elterliche FISH oder Chromosomenanalyse durchgeführt werden.

Scheinbar balancierte Rearrangements mit einer normalen CMA-Studie

In dieser Studie wurden in 30 Fällen (~0,8 %) einzelne scheinbar balancierte Translokationen oder Inversionen ohne andere Chromosomenanomalien durch Chromosomenanalyse entdeckt. Es wurde berichtet, dass ~40 % der Patienten mit multiplen kongenitalen Anomalien/mentaler Retardierung und einer de novo scheinbar balancierten Translokation kryptische Anomalien in der Nähe der Bruchpunkte oder ohne Bezug zu den Bruchpunkten aufweisen, die durch die CMA leicht entdeckt werden können.19,20 Die CMA hat jedoch in diesen 30 Fällen keine Kopienzahlveränderungen in der Nähe der Bruchpunkte entdeckt. Mehrere Faktoren können zu dieser Beobachtung beitragen. Die meisten der Rearrangements wurden auf der Grundlage der elterlichen Studien einer Untergruppe der Fälle vererbt, was bedeutet, dass sie mit größerer Wahrscheinlichkeit „wirklich“ ausgeglichen sind. Außerdem wurden Robertson’sche Translokationen, die in der Regel nicht zu Kopienzahländerungen des Euchromatins führen, in dieser Studie berücksichtigt, in den veröffentlichten Studien jedoch ausgeschlossen. Darüber hinaus können kleine kryptische Deletionen/Duplikationen in der Nähe der Bruchpunkte übersehen werden, da die für die meisten dieser Fälle verwendeten Arrays gezielt eingesetzt wurden und nicht über eine ausreichende genomische Auflösung verfügten, um ein Ungleichgewicht zu erkennen.

Obwohl die meisten balancierten Rearrangements gutartig sind, sind De-novo-Rearrangements aufgrund einer kryptischen Deletion oder Duplikation, einer Gen- oder Enhancer-Störung, Positionseffekten oder epigenetischen Effekten mit einem höheren Krankheitsrisiko verbunden. Das Risiko einer schwerwiegenden kongenitalen Anomalie liegt bei de novo reziproken Translokationen und Inversionen bei 6,7 %.21 Es wird erwartet, dass das Risiko bei Fällen mit einer normalen CMA unter Verwendung eines Ganzgenom-Arrays geringer ist. Daher ist es weniger wahrscheinlich, dass die in dieser Studie entdeckten einfachen balancierten Rearrangements die Ursache für den Phänotyp der Patienten sind.

Evidenzbasierte Strategie zur effizienten Erkennung von Chromosomenanomalien

Um festzustellen, ob und wann eine Chromosomenanalyse für die klinische Diagnose von Chromosomenanomalien durchgeführt werden sollte, haben wir die Ergebnisse von Fällen untersucht, die gleichzeitig mit CMA und Chromosomenanalyse untersucht wurden. Chromosomenanomalien, die durch die Chromosomenanalyse entdeckt, aber durch die CMA völlig übersehen wurden, wurden in ~1 % der Fälle beobachtet, einschließlich scheinbar ausgeglichener Rearrangements in 0,8 % der Fälle und Ungleichgewichte in Verbindung mit Mosaizismus in 0,16 % der Fälle. Darüber hinaus erleichterte die Chromosomenanalyse den Nachweis chromosomaler struktureller Rearrangements in 18 % der Fälle mit abnormalen CMA-Ergebnissen.

Obwohl die CMA Informationen über Kopienzahlvariationen und Mosaizismus liefert, liefert nur die Chromosomenanalyse oder FISH die mit diesen Kopienzahlveränderungen verbundenen chromosomalen Strukturinformationen und identifiziert einige Fälle von Mosaizismus, die von der CMA nicht erkannt werden. Der Vorteil von FISH gegenüber der Chromosomenanalyse besteht darin, dass kleine (<3-10 Mb) Kopienzahlveränderungen nachgewiesen werden können und eine große Anzahl von Kernen schnell analysiert werden kann, was besonders für die Bewertung von Mosaizismus nützlich ist. Daher kann nach einer abnormalen CMA zunächst eine FISH-Analyse durchgeführt werden, um strukturelle Rearrangements in Verbindung mit Kopienzahlveränderungen nachzuweisen, Mosaizismus zu bestätigen und den Prozentsatz der abnormalen Zellen zu bestimmen. Wenn durch FISH Insertionen oder Translokationen festgestellt werden, kann eine Chromosomenanalyse angezeigt sein, um die betroffenen Chromosomen zu bestimmen. Anstelle der Standard-Chromosomenanalyse, bei der 20 Metaphase-Zellen aus zwei Kulturen untersucht werden, ist eine Chromosomenanalyse in kleinem Maßstab an fünf Zellen aus einer Kultur ausreichend für diesen Zweck. Bei Fällen mit einem normalen Ergebnis der CMA kann eine vollständige Chromosomenanalyse in Betracht gezogen werden, wenn der Patient mehrere angeborene Anomalien, dysmorphe Merkmale und/oder geistige Retardierung aufweist, die auf ein Chromosomensyndrom hindeuten, oder klinische Manifestationen, die auf einen möglichen Mosaizismus hindeuten, wie z. B. Pigmentanomalien, die zufällig verteilt sind oder den Linien von Blashko folgen, und Wachstumsasymmetrie in Verbindung mit geistiger Behinderung. Auf der Grundlage dieser Studie hätten ~1% der Fälle informative Chromosomenergebnisse, aber <0,001 der Fälle (3/3.710) hätten einen klinisch bedeutsamen Befund.

Zusammenfassend bestätigt unsere Studie erneut, dass fast alle Chromosomenanomalien, die durch eine Chromosomenanalyse nachgewiesen werden können, durch die CMA entdeckt werden, was die Empfehlung unterstützt, dass die CMA der Test der ersten Stufe sein sollte. Die herkömmliche zytogenetische Analyse ist jedoch nach wie vor nützlich für den Nachweis von Mosaik und die Charakterisierung struktureller Rearrangements.