Les systèmes inductibles par la tétracycline ont été largement utilisés chez la levure pour étudier le contrôle de la transcription des gènes dans des cellules uniques15,16,17,18,19,20,21,22. Pour utiliser la rtTA dans ce contexte, nous avons créé deux puissants promoteurs sensibles à la doxycycline avec trois (PTET3) ou quatre (PTET4) sites de liaison de la rtTA et utilisé la variante optimisée rtTA-M27 pour contrôler l’expression de la protéine fluorescente verte enrichie en levure (yeGFP)23 à partir de ces promoteurs (Fig. 1a). La cassette d’expression rtTA/PTET-yeGFP a été intégrée en une seule copie dans le génome de la levure. Le variant M2 est identique au variant trouvé dans les systèmes d’expression Tet-ON Advanced de ClonTech.
rtTA-M2 présente une activité significative en l’absence d’induction par la doxycycline.
(a) Schéma du montage expérimental où rtTA-M2 est exprimé à partir des promoteurs constitutifs PMYO2 ou PTDH3 et yeGFP est exprimé à partir d’un promoteur sensible à la tet. (b) Activation de rtTA-M2 exprimée à partir de PMYO2 ou PTDH3 en fonction de la dose de doxycycline (moyenne +/- s.e.m. de trois répétitions techniques). AutoFL représente des cellules de levure BY4742 de type sauvage. (c) Distributions de la fluorescence unicellulaire obtenue à partir de cellules portant le système PMYO2-rtTA à différentes concentrations de doxycycline. Les nuances de gris progressivement plus foncées correspondent respectivement à 0,25, 1, 5 et 100 μg/mL de doxycycline. L’AutoFL correspond à des cellules de levure BY4742 de type sauvage. (d) Images fusionnées en champ clair-fluorescence de cellules de levure BY4742 de type sauvage ou de cellules non induites portant le système PMYO2-rtTA.
Le problème de la fuite de transcription du gène cible est particulièrement profond lorsque le rtTA est exprimé à des niveaux élevés. Ceci est illustré dans la figure 1b qui montre les courbes de réponse à la dose de doxycycline de PTET3 lorsque rtTA-M2 est exprimé à partir du puissant promoteur PTDH3. La fluorescence était très élevée lorsque les cellules étaient exposées à des quantités saturantes de doxycycline. Néanmoins, en raison d’une transcription fuyante à partir du promoteur PTET3, la gamme dynamique du système était plutôt pauvre, l’expression maximale étant ~17 fois plus importante à l’induction complète par rapport à l’absence de doxycycline.
Conforme à un modèle où le transactivateur a un potentiel d’activation important dans son état non induit, l’expression de rtTA-M2 à partir du promoteur faible PMYO2 a considérablement réduit la fluorescence en l’absence de doxycycline. Bien que la saturation complète n’ait pas été observée avec ce système, la réduction de l’expression de fuite a entraîné une amélioration radicale de la gamme dynamique et l’induction avec la doxycycline a entraîné une augmentation d’environ 200 fois de la fluorescence. Cependant, malgré cette amélioration, les données de cytométrie en flux (figure 1c) et les données de microscopie à fluorescence (figure 1d) indiquent que la rtTA-M2 non induite provoque une expression significative du gène rapporteur, même lorsque le transactivateur est exprimé à partir d’un promoteur faible.
Lors du test initial de douze clones portant le système PTDH3-rtTA-M2, nous avons découvert par sérendipité que l’un d’entre eux émettait une fluorescence étonnamment faible en l’absence de doxycycline, mais une fluorescence presque normale à pleine induction (Fig. 2a). Le séquençage ultérieur a permis d’identifier une mutation d’un seul nucléotide, de la guanine à la thymine, qui change une glycine (GGG) en une valine (GTG) au niveau du résidu 72 de la protéine transactivatrice. L’analyse Western blot a indiqué que cette substitution n’affecte pas l’abondance de la protéine (figure 2a, insérer, voir la figure supplémentaire S1 pour plus de détails) et la reconstruction du système d’expression a confirmé que la mutation unique guanine à thymine est responsable des changements observés dans la réponse à la dose de doxycycline (données non présentées).
La mutation de la glycine 72 dans rtTA-M2 diminue l’activité basale à des niveaux indétectables.
(a) Activation dose-dépendante de la doxycycline des variants de rtTA-M2 exprimés à partir de PTDH3 (moyenne +/- s.e.m. de trois répliques techniques). AutoFL représente des cellules de levure BY4742 de type sauvage. Dans l’encadré, un western blot (recadré) comparant les abondances de protéines de rtTA-M2 et du mutant G72V. Tous les échantillons ont été préparés et analysés dans des conditions expérimentales identiques. (b) Distributions de la fluorescence unicellulaire obtenue à partir de cellules portant le système PTDH3-rtTA(G72V) à différentes concentrations de doxycycline. AutoFL représente les cellules de levure BY4742 de type sauvage. Les nuances de gris progressivement plus foncées correspondent respectivement à 1, 2,5, 5 et 100 μg/mL de doxycycline. (c) Images fusionnées en champ clair-fluorescence de cellules non induites portant les systèmes PTDH3-rtTA-M2 ou PTDH3-rtTA(G72V). (d) Représentation cartographique du dimère TetR dans laquelle chaque protomère est coloré différemment (jaune et turquoise). La structure secondaire est étiquetée et G72 est représenté sous forme de sphère.
Le système PTDH3-rtTA-M2(G72V) présente une plage dynamique remarquable et a montré une augmentation d’environ 500 fois de l’intensité de la fluorescence lorsque les cellules ont été induites avec une forte dose de doxycycline par rapport à l’absence d’induction (figure 2b). De plus, l’émission de fluorescence détectée par cytométrie en flux est indiscernable de l’auto-fluorescence cellulaire en l’absence de doxycycline et la variante préserve la réponse d’induction graduelle du transactivateur original. De plus, l’expression du rapporteur de la souche rtTA-M2(G72V) non induite était indétectable par microscopie à fluorescence, même dans des paramètres d’instrumentation où la souche rtTA-M2 non induite donnait un fort signal saturant (Fig. 2c).
Pour mieux comprendre comment la mutation unique peut avoir un impact aussi drastique sur la gamme dynamique de rtTA-M2(G72V), nous avons étudié où le résidu était situé dans le contexte de la structure tridimensionnelle de la protéine. La structure de rtTA-M2 ou d’autres variantes de rtTA n’a pas été résolue. Cependant, comme 203 des 207 acides aminés du domaine TetR de rtTA sont conservés7, la structure à haute résolution de TetR24 donne un aperçu de la structure du domaine de liaison à l’ADN de rtTA. Dans la structure de TetR, le résidu 72 de la glycine correspond à une boucle flexible située entre les α-hélices α4 et α5, une région qui relie le domaine de liaison à l’ADN du répresseur (α1-α3) et sa région de liaison à la tétracycline (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Cela suggère que la substitution, qui introduit une chaîne latérale non polaire, déclenche des changements conformationnels à longue portée qui affectent finalement l’activité du transactivateur, vraisemblablement en rigidifiant sa structure tertiaire.
Pour examiner cette hypothèse, nous avons créé deux variantes supplémentaires dans lesquelles le résidu glycine a été muté en alanine ou en proline. Ces mutations préservent la nature non polaire du résidu valine mais introduisent des chaînes latérales de taille variable. Nous avons prévu que la chaîne latérale unique de méthyle de l’alanine serait moins efficace pour empêcher l’activité non induite que la grande chaîne latérale cyclique de la proline. Nous avons également créé un système d’expression inductible par le β-estradiol26 pour obtenir un contrôle direct de l’expression de rtTA-M2 et utilisé le promoteur avec un site de liaison TetR supplémentaire, PTET4, pour améliorer la capacité de rtTA à se lier à l’ADN. Le système d’expression est illustré schématiquement dans la (Fig. 3a). Nous avons confirmé par analyse western blot que les quatre variantes de rtTA sont exprimées à des niveaux similaires à l’induction complète du β-estradiol (Fig. 3b, voir la Fig. S2 supplémentaire pour plus de détails) et que la fluorescence d’une souche dépourvue de rtTA a une expression de rapporteur qui est indiscernable d’une souche de levure BY4742 de type sauvage, démontrant qu’il n’y a pas d’expression de rapporteur de fond de PTET4 (Fig. supplémentaire. S3).
Les chaînes latérales non polaires au niveau du résidu 72 sont un déterminant clé de l’activité basale.
(a) Schéma du réseau de gènes où les variants rtTA-M2 sont exprimés à partir d’un promoteur inductible par le β-estradiol et où yeGFP est exprimée à partir d’un promoteur sensible au tet. (b) Western blot (recadré) comparant l’abondance des protéines des quatre variants rtTA lorsqu’ils sont induits par 1000 nM de β-estradiol ou sans induction. Tous les échantillons ont été préparés et analysés dans des conditions expérimentales identiques. (c) Images fusionnées en champ clair-fluorescence des quatre variantes de rtTA induites par 1000 nM de β-estradiol sans induction par la doxycycline. (d) L’activité basale des variantes de rtTA en fonction de leur niveau d’expression dépendant du β-estradiol (moyenne +/- s.e.m de trois réplicats techniques). En médaillon, histogrammes de l’expression du rapporteur pour les différents variants de rtTA. (e) Activation dose-dépendante de la doxycycline des variants rtTA-M2 exprimés de manière ubiquitaire dans 1000 nM de β-estradiol (moyenne +/- s.e.m de trois réplicats techniques).
Comme prévu, le variant alanine a montré une expression de fuite plus élevée que le variant valine et le variant proline avait une fluorescence indiscernable de l’auto-fluorescence cellulaire mesurée par cytométrie de flux. Ceci est apparent dans les images de microscopie à fluorescence obtenues avec des réglages d’instruments où la souche hébergeant le variant M2 original donne un fort signal de fluorescence à pleine induction de β-estradiol (Fig. 3c) et dans les mesures de fluorescence par cytométrie en flux à une induction de β-estradiol variable (Fig. 3d).
Remarquablement, les substitutions d’acides aminés qui réduisent significativement l’expression basale du gène rapporteur ont un effet minimal sur l’activation transcriptionnelle de rtTA à pleine induction de β-estradiol et de doxycycline. Ceci est illustré dans la Fig. 3E, qui montre les courbes dose-réponse pour les quatre variantes G72-M2 mesurées lorsque la doxycycline varie à pleine induction de β-estradiol. Cependant, les substitutions d’acides aminés ont un impact sur la sensibilité à la doxycycline. Dans nos expériences (figure 3e), le variant M2 présentait la plus grande sensibilité avec une concentration efficace demi-maximale (EC50) de ~0,06 μg/mL, tandis que le variant alanine (EC50 de ~0,2 μg/mL), le variant valine (EC50 de ~1,0 μg/mL) et le variant proline (EC50 de ~1.5 μg/mL) ont nécessité des concentrations de doxycycline progressivement plus élevées pour atteindre la capacité d’expression maximale.
Pour contrer l’effet de la mutation G72 sur la sensibilité à la doxycycline, nous avons introduit des mutations supplémentaires dans le domaine TetR qui ont récemment montré qu’elles augmentaient la sensibilité à la doxycycline10,11,27. Nous avons spécifiquement examiné l’effet de l’introduction des mutations améliorant la sensibilité (SE) V9I, F67S, F86Y et R171K.
La figure 4A,B démontre que les mutations SE améliorent la sensibilité à la doxycycline des variants rtTA M2 SE-G72P et SE-G72A. Lorsque les variants rtTA sont exprimés à des niveaux élevés à partir du promoteur inductible du β-estradiol pleinement activé (figure 3a), l’introduction des mutations SE réduit la CE50 de la doxycycline de ~1,5 μg/mL à ~0,1 μg/mL pour le variant G72P (figure 4a) et de ~0,2 μg/mL à ~0,02 μg/mL pour le variant G72A (figure 4b). Cet effet s’est produit sans changement appréciable de l’expression du rapporteur sous induction complète par la doxycycline et n’a pas compromis la gamme dynamique du variant SE-G72P. Il est toutefois intéressant de noter que les mutations SE ont provoqué une perte significative de la gamme dynamique du variant SE-G72A en augmentant l’expression du gène rapporteur en l’absence de doxycycline.
La sensibilité à la doxycycline des nouveaux variants rtTA peut être améliorée par l’ajout de mutations améliorant la sensibilité.
(a,b) Activation dose-dépendante de la doxycycline des variants rtTA exprimés de manière ubiquitaire dans le β-estradiol 1000 nM (moyenne +/- s.e.m de trois réplicats techniques). (c-f) Heatmaps affichant l’expression du rapporteur (Unités arbitraires) en fonction de l’expression du transactivateur dépendant du β-estradiol et de l’induction par la doxycycline.
Pour explorer davantage la relation entre le niveau d’expression du rtTA, la CE50 de la doxycycline et l’activité basale, nous avons examiné l’effet sur l’expression du gène rapporteur de la variation simultanée de l’induction par le β-estradiol et la doxycycline. Nous avons étudié quatre variantes M2 différentes ; la variante originale, la variante originale avec les mutations SE, la variante G72P et la variante SE-G72P.
La surface dose-réponse bidimensionnelle pour la variante originale M2 contient trois régions distinctes d’expression du rapporteur correspondant à une expression faible, intermédiaire et élevée du gène rapporteur. Ces régions sont marquées I, II et III sur les figures 4c-f. La région III est celle où l’expression du rapporteur est maximale, ce qui dépend à la fois du niveau d’expression de la rtTA et du niveau d’induction de la doxycycline. La région II est celle où l’expression du rapporteur est relativement élevée même lorsque l’induction par la doxycycline est faible. La région I est celle où l’expression du rapporteur est faible en raison d’un faible niveau de β-estradiol ou d’une faible induction de doxycycline.
Les mutations SE seules (figure 4d) augmentent considérablement l’expression du rapporteur dans une partie de la région I et dans toute la région II. Cela confirme que ces mutations peuvent améliorer la sensibilité dans une gamme étroite de niveaux d’expression de la rtTA, mais provoquent également une augmentation significative de l’activité de la rtTA à l’état non induit. En revanche, la mutation G72P seule (Fig. 4e) réduit considérablement l’expression du rapporteur dans toute la région II et dans une partie de la région III. Cela confirme que l’effet profond de cette mutation sur l’activité de la rtTA à l’état non induit est associé à une perte générale de sensibilité à la doxycycline.
La figure 4f montre l’effet de la combinaison des mutations SE et G72P. Par rapport à la variante SE (figure 4d), l’ajout de la mutation G72P contrecarre l’augmentation de l’expression du rapporteur causée par les mutations SE dans la région I et réduit l’expression du rapporteur à des niveaux indétectables dans cette région. De plus, par rapport à la variante G72P (Fig. 4e), l’ajout des mutations SE rétablit presque complètement la perte d’expression du rapporteur dans la région III. En d’autres termes, la sensibilité est améliorée sans introduire une fuite de l’expression du gène cible à n’importe quel niveau d’expression du transactivateur.