Charactérisation de l’anti-inflammatoire Lactobacillus reuteri BM36301 et de ses bénéfices probiotiques sur des souris âgées

Caractérisation des bactéries lactiques probiotiques

Nous isolons depuis des années des bactéries lactiques (BL) à partir de diverses sources, notamment les humains, les animaux, les plantes et les produits alimentaires. Ces collections de micro-organismes Benebios (BM) sont composées de plus de 500 souches, avec des potentiels probiotiques révélés dès leurs premiers criblages. Dans cette étude, nous avons choisi quatre souches commensales humaines dérivées d’échantillons fécaux et les avons étudiées en détail (Tableau 1). Celles qui ont été spécifiquement examinées sont deux souches de Lactobacillus reuteri (BM36301 et BM36304), une souche de L. gasseri (BM33601) et une souche de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Nous avons examiné les bactéries en fonction de leurs qualifications générales en tant que probiotiques (tableau 1). Tout d’abord, ces souches de BM ont montré une résistance aux acides (pH 2,5) et aux sels biliaires (0,3 %), démontrant une fourchette de taux de survie de 43 % à 98,5 % après 1 h de traitement à 37 °C, ce qui constitue des scores raisonnablement élevés . Ensuite, nous avons testé les activités antimicrobiennes contre les bactéries entériques. Alors que L. gasseri BM33601 a montré une inhibition minime de la souche d’essai E. coli, toutes les autres ont formé des zones inhibitrices distinctes (distance de 0,5 à 3 mm des bords du LAB). Ces effets inhibiteurs sont généralement causés par les bactériocines, les acides organiques (acide lactique ou acide acétique), le peroxyde d’hydrogène ou l’éthanol provenant des BL . Enfin, nous avons examiné leur capacité à se lier aux cellules épithéliales intestinales humaines (IEC) in vitro. Pour ce faire, nous avons cultivé des cellules cancéreuses du côlon humain, HT-29, sur des lamelles pendant 15 jours et nous avons appliqué des cultures de LAB vivantes sur celles-ci pendant 1 h (Méthodes). Après un lavage approfondi, les cellules bactériennes restantes ont été visualisées par coloration de Gram pour être comptées au microscope . Les souches L. reuteri BM36301 et BM36304 ont montré des scores de rétention élevés (5,5-7,4 bactéries par HT-29), tandis que L. gasseri BM33601 avait des scores modérés (1,7 bactéries par HT-29) et B. animalis subsp. lactis BM10307 avait des scores faibles (0,3 bactéries par HT-29). L’adhésion plus forte des BL aux CEI est particulièrement importante puisqu’elles doivent rester dans la couche de la muqueuse intestinale suffisamment longtemps pour que les avantages fassent effet sur l’hôte . À partir de ces expériences primaires, les deux souches de L. reuteri ont révélé un potentiel plus élevé en tant que probiotiques de qualité.

Régulation de la production de TNF-α par les bactéries lactiques in vitro

Nous avons cherché à cribler les LAB pour leur potentiel à supprimer l’inflammation intestinale. À cette fin, nous avons adapté un système de culture tissulaire in vitro où les cellules myéloïdes humaines (THP-1) sécrètent du TNF-α lors de l’activation de leurs récepteurs Toll-like (TLR) par le lipopolysaccharide bactérien (LPS) . Tout d’abord, nous avons vérifié que des cellules THP-1 de 5 × 104 dans 1 ml de culture traitées avec du LPS à la dose de 150 ng/ml pendant 3,5 h entraînent généralement une production de 200-300 pg/ml de TNF-α (Fig. 1a, voies 1 et 2). Ensuite, nous avons recueilli les surnageants des cultures bactériennes cultivées pendant 24 h, les avons séchés sous vide et avons reconstitué le milieu conditionné (CM) (Méthodes). Ce CM contient des activités complexes permettant à la fois de supprimer et d’induire le TNF-α, en fonction du LAB et des conditions de culture . En effet, nous avons observé une légère production de TNF-α par les CMs de BM36304 et BM36301 sans LPS, mais cette quantité était inférieure à 20 % de l’induction stimulée par le LPS (données non montrées). Enfin, nous avons ajouté chaque CM jusqu’à 5 % de la culture de THP-1 (v/v) en présence de LPS (Fig. 1a, voies 3-6). La production de TNF-α avec LPS (208 ± 49 pg/ml, voie 2) a été supprimée à 40 % avec le CM de L. reuteri BM36301 (90.90 ± 49.3 pg/ml, voie 3), et à 52 % avec le CM de B. animalis subsp. lactis BM10307 (118.8 ± 19.0 pg/ml, voie 6). Pour notre sélection, nous avons considéré comme anti-inflammatoire la suppression de l’expression du TNF-α proche ou inférieure à 50 % par le traitement au LPS. Cependant, les CM de L. reuteri BM36304 et de L. gasseri BM33601 n’ont pas été capables de supprimer la production de TNF-α à ce point. Nous avons vérifié cette activité inerte en préparant ces CM dans diverses conditions de culture (données non présentées).

Puis, nous avons examiné la capacité d’induction du TNF-α des cellules bactériennes elles-mêmes car les composants cellulaires des bactéries Gram positives peuvent induire des réponses inflammatoires . À cette fin, nous avons cultivé les bactéries jusqu’à une phase exponentielle (16 h), puis récolté, lavé et ajouté ces cellules bactériennes vivantes en excès (nombre de cellules 250 fois supérieur) à la culture THP-1. Les activités métaboliques des cellules bactériennes ont été maintenues au minimum par des antibiotiques ajoutés dans le milieu THP-1. Après 6 heures d’incubation, le TNF-α sécrété a été mesuré quantitativement (Fig. 1b). Même si les quatre cellules LAB ont induit du TNF-α, BM36301 a produit une quantité significativement plus faible (609 pg/ml) que les autres : BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml), et BM10307 (7141 pg/ml). Au cours de cette co-incubation de 6 heures, nous avons observé que les cellules THP-1 ont subi une mort cellulaire variable en fonction de la LAB utilisée (Additional file 1). Notamment, BM36301, le plus faible inducteur de TNF-α, a causé la plus faible quantité de mort de THP-1 (9,7 %), alors que les autres souches à plus forte induction de TNF-α ont causé une mort significativement plus importante (24-38 %). Par conséquent, il n’est pas vrai que la BM36301 a induit un faible taux de TNF-α en raison de la perte de viabilité des THP-1 en soi. Pour nos besoins de criblage, nous avons considéré les LAB avec une production active de TNF-α de plus de 1000 pg/ml comme pro-inflammatoires.

En résumé, les activités d’immunomodulation in vitro ont été attribuées comme anti-inflammatoires avec le CM suppressif (BM36301 et BM10307) et pro-inflammatoires avec les cellules vivantes inductives (BM36304, BM33601 et BM10307). Puisque BM10307 a montré les deux activités, nous l’avons attribué comme possédant une double fonctionnalité (Fig. 1c). Il était intéressant de noter que les deux souches de L. reuteri présentaient des activités distinctes. Lors du criblage initial de notre large gamme de collections de BM, les souches anti-inflammatoires se sont avérées plutôt rares, avec un taux de découverte de moins de 5 % (données non présentées). De même, certaines souches n’ont montré aucune activité, entrant ainsi dans la catégorie  » neutre  » (données non présentées).

Les molécules suppressives des BM sont stables face à la chaleur et à la trypsine

Puisque les BM de LAB sont composées de divers métabolites bactériens ainsi que de composants cellulaires, nous avons cherché à mieux comprendre la nature anti-inflammatoire des BM. L’expression du TNF-α a quantitativement diminué avec des concentrations croissantes des CM de L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) et de B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). Il est intéressant de noter qu’une plus petite quantité de CM de BM36301 (0,5× l’entrée ou 2,5 % v/v) a en fait induit le TNF-α davantage, ce qui est cohérent avec l’observation que ce CM contient des matériaux induisant le TNF-α dans une certaine mesure (Fig. 2a, voies 2 et 3). Néanmoins, les effets suppressifs sont devenus dominants en face des quantités plus élevées de CM, suggérant que les matériaux anti-inflammatoires sont quantitativement additifs et que les récepteurs correspondants sur la surface de cellules de THP-1 sont assez abondants pour répondre facilement au traitement croissant de CM. Dans l’ensemble, ces observations suggèrent que les CM contiennent des métabolites actifs responsables de la suppression du TNF-α, malgré leur nature complexe.

Nous avons ensuite examiné les caractéristiques physico-chimiques des matériaux anti-inflammatoires dans les CMs. L’ébullition des CM de chaque souche pendant 10 min s’est avérée inefficace pour altérer leurs fonctions inhibitrices du TNF-α par rapport aux CM natifs (figure 2c, voies 3 et 4). De même, le traitement à la trypsine n’a pas affecté leurs activités (Fig. 2c, voie 5). Ces observations suggèrent que les principaux facteurs inhibiteurs de ces CMs ne sont ni des protéines ni des molécules thermosensibles.

Régulation du TNF-α chez la souris avec des bactéries probiotiques

La question ultime concernant la régulation in vitro du TNF-α basée sur notre criblage LAB était de savoir dans quelle mesure elle serait pertinente avec les applications in vivo. Nous avons directement cherché à répondre à cette question en appliquant les souches de L. reuteri sélectionnées à un système modèle de souris. Nous avons préparé des souris consanguines C57BL/6 âgées de 20 semaines, soit 6 mâles et 8 femelles par groupe. Puis, sur une période de 20 semaines, un groupe a été traité avec l’anti-inflammatoire BM36301, un autre groupe a été traité avec le pro-inflammatoire BM36304, et le groupe témoin a été traité avec du dextrose (Méthodes). Afin de minimiser la détresse des animaux, les cultures LAB ont été administrées dans l’eau de boisson afin de respecter la dose de consommation quotidienne de 1 × 106 bactéries par souris. Nous avons également fourni un régime alimentaire standard afin que le processus de vieillissement soit naturel pendant la période. À la fin de l’incubation de 20 semaines (âge total de 40 semaines), nous avons euthanasié les souris et prélevé du sang pour la préparation du sérum afin de mesurer les cytokines et la testostérone par des méthodes ELISA quantitatives. Lors de la nécropsie, nous n’avons trouvé aucune anomalie morphologique grossière.

En résumé, nous avons observé une réduction du TNF-α sérique avec l’anti-inflammatoire BM36301, avec un effet plus prononcé observé chez les femelles. Le pro-inflammatoire BM36304 a conduit à une augmentation du TNF-α chez les mâles, mais pas chez les femelles. Ces résultats suggèrent que notre dépistage in vitro porte une pertinence significative avec le maintien in vivo du TNF-α dans ces essais sur les souris.

L. reuteri BM36301 a maintenu une prise de poids corporel réduite et une testostérone élevée chez les souris mâles

Le vieillissement est la source de nombreux problèmes de santé chez les humains, notamment le diabète et l’obésité. Afin d’exacerber ces problèmes de vieillissement dans le modèle animal, des régimes alimentaires riches en graisses sont souvent employés . Cependant, l’interprétation de ces expériences accélérées peut être compliquée car aucun vieillissement chez l’homme ne devrait être induit par un régime riche en graisses. Nous avons cultivé toutes les souris avec un régime standard afin que leur processus de vieillissement soit le plus naturel possible. Au cours des 20 semaines de l’expérience, à partir de l’âge de 20 semaines, les mâles du groupe témoin ont pris environ 8 g de poids (7,83 ± 1,2 g) et les femelles du groupe témoin ont pris environ 5 g de poids (4,8 ± 0,94 g). Il est remarquable de constater que le gain de poids des mâles nourris avec l’anti-inflammatoire BM36301 était significativement inférieur de 36 % à celui du groupe témoin (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) (Fig. 4a, voies 1 et 2). Cependant, le gain de poids des mâles traités par BM36304 (7,53 ± 0,74 g) n’était pas significativement différent du témoin (p = 0,67). Les gains de poids des groupes de femelles n’étaient pas statistiquement différents les uns des autres.

Une autre différence significative a été le taux d’insuline sérique des mâles traités par BM36304 (figure 4b). Alors que le groupe de mâles témoins présentait 3,18 ± 0,65 ng/ml d’insuline, le groupe de mâles nourris au BM36304 présentait 4,91 ± 0,63 ng/ml d’insuline (p = 0,027). Cependant, conformément au fait que la prise de poids de ce groupe n’était pas très différente de celle du groupe témoin (Fig. 4a), nous n’avons pas observé une accumulation de graisse abdominale plus importante chez les mâles traités par BM36304 (données non présentées). À l’âge de 40 semaines, le pic d’insuline n’a peut-être pas provoqué de diabète cliniquement évident chez les souris, mais la maladie peut s’aggraver si les souris vieillissent davantage. La variation de l’insuline entre les groupes de femelles n’était pas significativement différente les uns des autres.

Enfin, nous nous sommes concentrés sur les niveaux de testostérone des mâles. Comme le montre la figure 4c, les mâles nourris au BM36301 anti-inflammatoire ont conservé des niveaux significativement plus élevés de testostérone sérique (5,18 ± 0,87 ng/ml) que le groupe témoin (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Cependant, le groupe traité par le BM36304 n’était pas statistiquement différent (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) du groupe témoin. Afin de mieux comprendre les résultats concernant la testostérone, nous avons examiné les testicules de chaque souris. Le poids des testicules appariés des mâles nourris au BM36301 était de 0,579 ± 0,075 g, soit 10 % plus lourd que celui du témoin (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Si l’on considère le gain de poids plus faible dans le groupe BM36301 (Fig. 4a), cette différence de taille des testicules est plus évidente ; le rapport entre le poids des testicules et le gain de poids corporel (TW/WG) du témoin n’était que de 67 % de celui du groupe BM36301. Cependant, nous n’avons pas pu observer de différences microscopiques des tissus des testicules, comme le diamètre des tubules séminifères entre ces deux groupes (156,03 ± 6,65 μm du témoin contre 153,95 ± 18,66 μm des mâles traités par BM36301, p = 0,51). Nous n’avons pas réalisé d’autres études comme la comparaison de la spermatogenèse ou de la surface des cellules de Leydig.

En résumé, l’anti-inflammatoire BM36301 a aidé les mâles à maintenir une prise de poids plus faible avec des testicules plus gros et plus de testostérone en vieillissant. La réduction de la production de testostérone chez les mâles âgés a été proposée comme étant liée à des lésions des testicules dépendant de l’âge, vraisemblablement à la suite d’une insulte inflammatoire . Par ailleurs, la bactérie pro-inflammatoire BM36304 a déclenché une augmentation de l’insuline, sans toutefois modifier la prise de poids ou la testostérone chez les mâles. Notamment, aucune de ces souches bactériennes n’a eu d’influence significative sur ces mesures corporelles chez les souris femelles.

Une peau féminine saine grâce à l’anti-inflammatoire BM36301

Une caractéristique intéressante de certains probiotiques est qu’ils peuvent promouvoir la santé de la peau d’une manière qui dépend de la régulation immunitaire . Comme le BM36301 a également montré des effets anti-inflammatoires in vitro et in vivo, nous avons posé la question de savoir si cette souche peut provoquer de tels avantages pour la santé de la peau. À la 18e semaine de traitement, nous avons rasé une zone sur 2 souris de chaque groupe et les avons examinées après 1 semaine. Il est intéressant de noter que les souris femelles nourries au BM36301 ont présenté une repousse plus rapide des poils, mais pas une récupération complète, sur la zone rasée (Fig. 5a). En revanche, les groupes témoins ou BM36304 n’ont pas présenté un rythme de récupération aussi rapide. Aucun des hommes traités n’a montré une repousse des poils nettement plus rapide que le groupe témoin, ce qui indique que cette accélération de la croissance des poils n’est peut-être évidente que chez les femmes. Une autre façon d’évaluer la santé de la peau est d’examiner la brillance du pelage. Cependant, nous n’avons pas observé de différences significatives entre chaque groupe par des mesures sensorielles ou de luminomètre, principalement en raison de l’état relativement brillant de la fourrure des témoins (données non présentées).

Nous avons en outre évalué la santé de la peau en examinant des coupes transversales de la peau au microscope après coloration à l’hématoxyline et à l’éosine. Comme le montrent les figures 5b et c, nous avons constaté que les souris femelles traitées par le BM36301 présentaient un nombre plus élevé de follicules pileux sous-cutanés (HF) que les souris femelles témoins. Le nombre de follicules pileux par vue microscopique à une résolution de 400× était de 3,50 ± 0,52 pour le groupe de femelles témoins, tandis que le nombre était de 4,80 ± 0,61 pour les femelles nourries au BM36301, avec une différence significative (p = 0,023). Cependant, les femelles traitées au BM36304 n’ont présenté qu’un léger changement (4,15 ± 1,73, p = 0,55 par rapport au groupe témoin). Après une analyse plus détaillée des follicules pileux, nous avons constaté que les femelles nourries au BM36301 présentaient des stades du cycle pilaire légèrement plus actifs que le contrôle (anagène + catagène : télogène était de 81:19 pour le contrôle contre 95:5 pour les femelles nourries au BM36301). En revanche, les comptages de HF des groupes de mâles n’étaient pas très différents les uns des autres (Fig. 5b). Enfin, nous avons également évalué l’épaisseur de la peau mesurée comme la profondeur de l’épiderme au panniculus carnosus (Fig. 5c, fichier supplémentaire 1). Nous n’avons pas trouvé de grande différence de profondeur entre les femelles témoins et les femelles traitées au BM36301. Cependant, les couches dermiques des souris nourries au BM36301 se sont révélées marginalement plus profondes que celles des témoins, et le tissu adipeux des souris traitées au BM36301 était moins profond que celui des témoins. La plupart des HF sous-cutanés se trouvaient dans le derme.

Dans l’ensemble, ces observations suggèrent que le traitement avec l’anti-inflammatoire BM36301 a favorisé une peau plus saine, comme en témoignent la repousse des poils et le nombre d’HF chez les femelles. Cependant, les différences microscopiques des échantillons de peau entre le groupe témoin et le groupe BM36301 sont apparues plutôt marginales. Ces avantages pour la santé de la peau n’ont pas été observés chez les mâles. De même, le pro-inflammatoire BM36304 n’a pas provoqué d’effets indésirables sur la peau au moment des expérimentations.