Dans la photographie au flash, la lumière du flash se produit trop rapidement pour que la pupille se ferme, ainsi, une grande partie de la lumière très vive du flash entre dans l’œil par la pupille, se réfléchit sur le fond de l’œil à l’arrière du globe oculaire et ressort par la pupille. L’appareil photo enregistre cette lumière réfléchie. La principale cause de la couleur rouge est l’abondance de sang dans la choroïde qui nourrit l’arrière de l’œil et qui est située derrière la rétine. Le sang présent dans la circulation rétinienne est bien moins important que dans la choroïde et ne joue pratiquement aucun rôle. L’œil contient plusieurs pigments photostables qui absorbent tous dans la région des courtes longueurs d’onde, et contribuent donc quelque peu à l’effet des yeux rouges. Le cristallin coupe la lumière bleue et violette profonde, en dessous de 430 nm (selon l’âge), et le pigment maculaire absorbe entre 400 et 500 nm, mais ce pigment est situé exclusivement dans la minuscule fovéa. La mélanine, située dans l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et la choroïde, présente une absorption progressivement croissante vers les courtes longueurs d’onde. Mais le sang est le principal déterminant de la couleur rouge, car il est totalement transparent aux grandes longueurs d’onde et commence brusquement à absorber à 600 nm. La quantité de lumière rouge sortant de la pupille dépend de la quantité de mélanine dans les couches situées derrière la rétine. Cette quantité varie fortement d’un individu à l’autre. Les personnes à la peau claire et aux yeux bleus ont relativement peu de mélanine dans le fond de la rétine et présentent donc un effet « yeux rouges » beaucoup plus marqué que les personnes à la peau foncée et aux yeux bruns. Il en va de même pour les animaux. La couleur de l’iris elle-même n’a pratiquement aucune importance pour l’effet « yeux rouges ». Cela est évident car l’effet « yeux rouges » est le plus visible lorsque l’on photographie des sujets adaptés à l’obscurité, donc avec des pupilles complètement dilatées. Les photographies prises avec une lumière infrarouge par le biais d’appareils de vision nocturne montrent toujours des pupilles très lumineuses car, dans l’obscurité, les pupilles sont totalement dilatées et la lumière infrarouge n’est absorbée par aucun pigment oculaire.
Le rôle de la mélanine dans l’effet yeux rouges est démontré chez les animaux atteints d’hétérochromie : seul l’œil bleu présente l’effet. L’effet est encore plus marqué chez les humains et les animaux atteints d’albinisme. Toutes les formes d’albinisme impliquent une production et/ou un dépôt anormal de mélanine.
L’effet yeux rouges est observé sur les photographies d’enfants également parce que les yeux des enfants ont une adaptation plus rapide à l’obscurité : en cas de faible luminosité, les pupilles de l’enfant s’agrandissent plus tôt, et une pupille agrandie accentue l’effet yeux rouges.
Les opérateurs de suivi théâtral, positionnés presque en coïncidence avec une lumière très vive et quelque peu éloignés des acteurs, sont parfois témoins de l’effet yeux rouges chez les acteurs sur scène. L’effet n’est pas visible pour le reste du public car il dépend de l’angle très faible entre l’opérateur de suivi et la lumière.
Les opérateurs de suivi de théâtre sont parfois témoins de l’effet des yeux rouges chez les acteurs sur scène.