Le design des gènes, la technologie de fusion et les conditions de clivage TEV influencent la purification des peptides venimeux riches en disulfures oxydés chez Escherichia coli

L’utilisation des codons des gènes codant pour des peptides venimeux entraîne des différences d’expression

Vingt-quatre gènes de différentes longueurs codant pour des peptides venimeux de différentes espèces et contenant différents nombres de ponts disulfures ont été choisis pour explorer les effets de l’utilisation des codons sur les niveaux solubles des protéines purifiées. Ces gènes codent pour des peptides venimeux qui sont divers du point de vue de l’évolution, de la structure et de la fonction. L’expérience vise à évaluer si des changements subtils dans l’utilisation des codons peuvent affecter les niveaux d’expression des peptides recombinants dans E. coli. Trois variantes de chaque gène ont été initialement conçues par rétro-traduction de séquences de peptides de venin à l’aide d’un algorithme d’échantillonnage aléatoire répété de Monte Carlo pour sélectionner les codons de manière probabiliste à partir de tables de consultation de la fréquence des codons. L’utilisation des codons des 72 gènes conçus (3 variantes de 24 gènes) est présentée dans le fichier supplémentaire 5 : tableau S5 et reflète l’utilisation des codons des gènes d’Escherichia coli exprimés à des niveaux modérés à élevés. Cependant, les variantes de gènes créées incorporaient des changements dans les séquences primaires d’ADN qui reflètent l’échantillonnage aléatoire de la sélection des codons et la liberté globale permise par l’algorithme utilisé pour la conception des gènes. Ainsi, l’identité moyenne des séquences d’ADN par paire était de 79,8 % au sein des trois variantes des 24 ensembles de données.

Les 72 gènes ont été synthétisés et clonés à l’aide du système Gateway dans le vecteur d’expression procaryote pETG82A sous le contrôle d’un promoteur T7 et en fusion avec le gène codant pour le tag de fusion DsbC pour l’expression cytoplasmique. E. coli BL21 (DE3) pLys S ont été transformés avec les 72 plasmides et cultivés dans des milieux d’auto-induction. Les protéines de fusion ont été purifiées et l’intégrité et le rendement des protéines ont été mesurés par l’analyse de Caliper Labchip GXII (Fig. 1a). Selon le peptide d’intérêt, les fractions purifiées sont analysées sur le Caliper Labchip GXII principalement sous la forme d’une bande unique (peptides 1, 2, 3, 4…) ou d’une double bande (5, 8, 16, 18…). La bande unique représente la bonne population de protéines (His-DsbC-peptide) tandis que la bande inférieure (environ 29 kDa) correspond à la protéine His-DsbC seule après troncature/dégradation du peptide cible. Cette bande inférieure indique probablement qu’une partie de la population peptidique n’a pas été correctement repliée et a été dégradée pendant les processus d’expression ou de purification. La concentration de protéines représentée sur la figure 1b a été calculée en intégrant uniquement la bande du peptide His-DsbC à l’aide du logiciel Caliper. Les données, présentées dans la Fig. 1b, ont révélé que les rendements de la protéine de fusion purifiée variaient de ∼1 mg/L (pour la protéine de fusion 14) à plus de 100 mg/L (pour les protéines de fusion 4, 5, 8, 9, 10, 18 et 24). Pour la grande majorité des cibles (19/24), les quantités de protéines de fusion purifiées permettraient la purification à l’échelle du milligramme du peptide cible par litre de culture (en supposant un rendement de clivage et de purification autour de 100 %), tandis que pour les cinq peptides restants (6, 7, 11, 13 et 14), un volume de culture plus important serait nécessaire.

La corrélation entre la séquence primaire des variants de gènes et les propriétés qui ont été suggérées pour affecter l’expression a été analysée. Les motifs délétères, tels que les structures secondaires 5′ de l’ARNm, n’ont pas pu affecter les niveaux d’expression, car les gènes du venin étaient tous fusionnés à la même séquence 5′-prime, qui code pour le tag de fusion de la protéine. Il n’y avait aucune corrélation entre l’expression des protéines et le nombre de ponts disulfures, la taille des peptides, la valeur CAI et la teneur en GC (données non présentées). Cela suggère que les différences dans l’expression des gènes étaient déterminées par d’autres propriétés liées à la séquence, en particulier l’utilisation des codons. Afin d’étudier comment les changements dans l’utilisation des codons affectent les niveaux de peptides recombinants, la relation entre les rendements protéiques des variantes à expression faible, moyenne et élevée dans les 24 ensembles de données a été comparée. Les protéines de fusion s’exprimant à des niveaux inférieurs, qui concernent les peptides 6, 7, 11, 13 et 14 (Fig. 1), ont été exclues de l’analyse. Les données ont révélé que les rendements protéiques des variants d’expression élevée, moyenne et inférieure des peptides analysés étaient significativement différents. Ainsi, les expressers inférieurs ont produit en moyenne 65,1 mg/L de protéine de fusion recombinante, tandis que les rendements en protéine de fusion des expressers supérieurs étaient, en moyenne, de 87,55 mg/L (Fig. 1b). Ces différences sont significativement différentes (p = 0,01).

Pour évaluer quelles différences dans l’utilisation des codons pourraient expliquer les différences observées dans l’expression des protéines, l’utilisation des codons des variantes à faible et à forte expression a été comparée. Les tableaux d’utilisation des codons incluant les gènes contenant le tag de fusion sont présentés dans le tableau S6. Les principales différences dans l’utilisation des codons concernent en particulier un acide aminé, la cystéine, bien que de légers changements aient également été observés pour d’autres résidus, notamment l’arginine, l’asparagine, le glutamate, l’histidine, l’isoleucine, la phénylalanine et la sérine. Un résumé des données d’utilisation des codons pour ces 8 acides aminés est présenté dans le tableau 1. Le biais de codon observé pour les gènes à faible expression a révélé une préférence pour le codon Cys-TGC alors que dans les gènes à forte expression, le codon Cys-TGT est favorisé. En outre, dans les gènes à faible expression, le codon Cys-TGC est utilisé 1,38 fois plus fréquemment que le codon Cys-TGT, alors que dans les gènes à forte expression, le codon Cys-TGT n’est utilisé que 1,04 fois plus souvent que le codon Cys-TGC. Bien que d’autres facteurs puissent éventuellement intervenir, cette observation suggère que l’expression élevée des gènes codant pour des peptides nécessite une contribution similaire des codons Cys-TGC et Cys-TGT, ce qui signifie qu’un pourcentage plus élevé d’un codon par rapport à l’autre aura une incidence sur l’expression. L’utilisation des codons cystéine chez E. coli indique également une utilisation plus équilibrée des deux codons (tableau 1). Afin de rechercher les facteurs pouvant expliquer cette observation, la fréquence des acides aminés dans les gènes d’E. coli et dans les 24 peptides de venin sélectionnés pour cette étude et leurs protéines de fusion associées a été comparée. Les données, présentées dans la Fig. 2, ont révélé que la cystéine est ~12,5 et 3,5 fois plus fréquente dans les peptides du venin (14,3%) et dans les protéines de fusion recombinantes (4,1%), respectivement, que dans E. coli (1,16%). Ainsi, les données suggèrent que l’expression des peptides du venin à des niveaux élevés est favorisée par la présence des deux codons cystéine à une fréquence similaire dans les gènes synthétiques. Cela devrait éviter l’appauvrissement d’un codon lorsque les gènes sont exprimés à des niveaux très élevés.

Les niveaux d’expression des peptides de venin sont affectés par le tag de fusion

Cinq nouveaux vecteurs pour l’expression de protéines recombinantes dans E. coli ont été construits en insérant différents tags de fusion dans le backbone pHTP1. Toutes les étiquettes de fusion doivent être insérées à l’extrémité N-terminale des peptides recombinants (Fig. 3). Deux des vecteurs encodent des partenaires de fusion qui contiennent un peptide signal pour cibler l’expression du peptide venimeux dans le périplasme (pHTP4, pHTP6). Les autres étiquettes de fusion conduisent à l’expression de la protéine recombinante dans le cytoplasme (figure 3). Dans tous les cas, une étiquette 6HIS a été introduite pour permettre la purification en aval des protéines de fusion par chromatographie d’affinité au nickel immobilisé. Un site de clivage de la protéase TEV (tobacco etch virus) (ENLYFQ/G) a été introduit dans tous les gènes synthétiques pour permettre l’élimination du partenaire de fusion. En plus de la marque d’affinité 6HIS seule (pHTP1), les 5 nouveaux vecteurs incluent la disulfure isomérase DsbC ou la protéine de liaison au maltose (MBP). Un dérivé mutant inactif de DsbC a été produit pour essayer de distinguer les rôles de DsbC dans la solubilisation passive (concernant le rendement de la protéine de fusion) et l’activité redox (concernant le rendement du peptide cible correctement replié). La représentation schématique de tous les vecteurs utilisés dans cette étude est présentée dans la Fig. 3.

Sixteen well characterized venom peptides (dont 7 qui faisaient partie de l’expérience d’utilisation des codons décrite ci-dessus) avec différentes origines et représentant différents plis et schémas de liaison cystéine ont été sélectionnés pour cette étude (voir Tableau S3). Les 16 gènes synthétiques ont été insérés dans les six vecteurs d’expression différents (voir Tableau S2 et Fig. 3) générant un total de 96 plasmides recombinants. Les 96 constructions ont été transformées dans BL21 (DE3) pLysS. Les souches d’E. coli recombinantes ont été cultivées dans des milieux d’auto-induction afin d’obtenir des densités cellulaires élevées. Après la purification par affinité au nickel, une analyse systématique des électrophérogrammes de Labchip GXII a été effectuée pour déterminer la concentration des protéines purifiées et comparer le poids moléculaire apparent des protéines de fusion purifiées avec leur poids moléculaire théorique attendu. Les données, présentées dans la figure 4, ont révélé que les 16 peptides peuvent effectivement être produits en utilisant une étiquette de fusion. Selon le peptide et la fusion utilisés, les niveaux de protéines de fusion purifiées variaient de zéro (principalement lorsque les peptides étaient clonés dans pHTP1) à plus de 300 mg de protéine de fusion purifiée par litre de culture. Dans l’ensemble, les petits peptides semblent plus faciles à produire que les grands, mais il existe plusieurs contre-exemples (comme le T16 qui est le plus grand peptide de l’étude). Pour les peptides 2, 4, 7, 8, 9, 14 et 15, différents vecteurs ont semblé appropriés pour l’expression de la protéine de fusion mais dans la plupart des cas (13 sur 16) le vecteur pHTP4 (DsbC) a surpassé tous les autres vecteurs. En revanche, sans exception, l’expression soluble avec le tag 6HIS seul était toujours très faible. La présence du peptide signal a conduit à des niveaux d’expression plus élevés pour DsbC dans tous les cas (pHTP4 versus pHTP2) doublant en moyenne la quantité de protéine de fusion exprimée. Pour le MBP (pHTP6 versus pHTP5), sa présence donne une tendance similaire (10/16). Pour les six autres peptides, le niveau cytoplasmique était similaire (1, 5, 11) ou même nettement meilleur (2, 7, 14). Globalement sur 16 peptides, lorsque la DsbC périplasmique n’était pas la meilleure option, c’est la MBP cytoplasmique (pour les peptides 2 et 14) ou périplasmique (peptide 4) qui était la meilleure option. Enfin, l’inactivation de la fonction biologique de la DsbC n’a eu aucun effet sur les niveaux d’expression des protéines de fusion des peptides du venin, puisque l’expression de pHTP2 et pHTP3 était, en général, très similaire.

Le clivage de la fusion, le rendement en peptides et l’état d’oxydation correct sont principalement affectés par le partenaire de fusion et la concentration en DTT dans le tampon de clivage TEV

Les conditions optimales de clivage TEV pour libérer les peptides cibles des étiquettes de fusion sont affectées par plusieurs paramètres, notamment le rapport enzyme/substrat, la composition du tampon, la période d’incubation et la température. Pour étudier les conditions qui conduiraient au meilleur rendement de peptides de venin repliés, huit peptides ont été sélectionnés à partir de la liste de 16 produits dans l’expérience précédente (voir le fichier supplémentaire 3 : Tableau S3, peptides en italique, et Fig. 4, peptides dans les cases). Comme le partenaire de fusion DsbC a surpassé les autres étiquettes en termes de rendement des protéines de fusion et d’applicabilité générale, ces constructions ont été sélectionnées pour l’étude d’optimisation du clivage TEV. Le seul paramètre qui s’est avéré critique et qui a donc été ajusté dans cette expérience est la concentration de DTT (0, 0,1, 0,5 et 2 mM DTT) présente dans le tampon de clivage. En effet, si la protéase TEV nécessite des conditions réductrices pour un clivage optimal, une concentration excessive de DTT pourrait conduire à la réduction des ponts intra-disulfures des peptides et à une perte de repliement et d’activité biologique.

Après une période d’incubation de 18 h, une aliquote du mélange peptide de fusion TEV a été acidifiée. Une fraction (« avant » versus « après » le clivage du TEV) a été chargée sur le Caliper pour déterminer l’efficacité du clivage et un échantillon a été analysé sur le LC-MS pour quantifier la toxine et confirmer son état d’oxydation correct. L’efficacité du clivage, l’analyse de masse et les rendements en peptides sont résumés dans la figure 5. Le clivage a eu lieu dans les 32 conditions testées dans l’essai (efficacité variant de 30 à 100 %). Comme prévu, le clivage n’était pas complet en l’absence de DTT et complet avec la plus forte concentration de DTT. Sur huit peptides, sept ont pu être détectés oxydés en quantités de mg par litre de culture. Sur les 32 échantillons, 19 ont donné la masse oxydée correcte sur le LC-MS avec des rendements différents selon la concentration de DTT pendant le clivage. Pour les 13 échantillons restants, aucun pic n’a été détecté sur le LC-MS. Parmi les sept peptides correctement détectés à différentes concentrations de DTT, quatre ont donné la récupération la plus élevée avec 0,1 mM de DTT, tandis que deux n’avaient pas besoin de DTT et un avait besoin de 0,5 mM de DTT pour une récupération optimale (Fig. 5, en gras). Une concentration de DTT de 0,1 mM est apparue comme le meilleur compromis à conserver pour les expériences suivantes et le pipeline de production du projet VENOMICS. Des aliquotes des 7 peptides ont été concentrés à 2 et 4 mg/mL et soumis à la même expérience avec 0,1 mM de DTT pour confirmer que le clivage serait possible dans ces conditions. En moyenne, l’efficacité a chuté de 20% mais s’est produite dans tous les cas (données non présentées).

Après optimisation des conditions de clivage, les 96 protéines de fusion purifiées (16 dans 6 vecteurs, voir Fig. 4) ont été clivées en présence de 0,1 mM de DTT à la concentration des pools purifiés (allant le plus souvent de 0,2 à 2 mg/mL) selon le protocole décrit ci-dessus. Après clivage et acidification, une aliquote des 96 échantillons a été analysée par LC-MS pour confirmer la masse moléculaire correcte, le rendement et l’état d’oxydation du peptide recombinant final du venin. Lorsqu’ils ont été détectés, les 96 peptides recombinants avaient des masses moléculaires en accord avec les masses attendues pour des résidus de cystéine complètement oxydés (voir l’article d’accompagnement pour plus de détails sur l’analyse par spectrométrie de masse) ; les formes réduites des protéines n’ont jamais été détectées (données non montrées), probablement en raison de la précipitation des peptides incorrectement oxydés pendant les étapes de clivage et d’acidification. Le rendement final pour les 96 constructions, présenté dans la Fig. 6, a été exprimé en rendement final absolu de peptides en mg/L de culture ou normalisé à 100 % pour chaque peptide par rapport au vecteur utilisé pour l’expression. Les données (Fig. 6) ont révélé que les 16 peptides étudiés pouvaient être produits par recombinaison, mais à des niveaux différents. Comme pour le rendement obtenu pour les variantes de fusion (Fig. 4), une tendance générale suggère que les peptides les plus courts sont plus faciles à produire que les plus longs. Le rendement final en peptides de venin varie considérablement, avec une différence de 50 fois entre le pire cas (0,3 mg/L, T10 dans pHTP6) et le meilleur cas (17,6 mg/L, T1 dans pHTP4). L’ensemble de données a également révélé une baisse significative des rendements après le clivage de l’étiquette de fusion. Cela est probablement dû aux conditions de récupération difficiles après le clivage (acidification dans de l’acétonitrile à 5 %, acide formique à 0,1 %) où, en plus de la protéase TEV, tout peptide mal replié et clivé précipite. Comme prévu d’après les rendements de fusion, même si la récupération est élevée, les peptides produits avec pHTP1 ont donné les plus faibles quantités de peptides dans l’ensemble (0,4 mg/L en moyenne, avec un maximum de 1,9 mg/L pour T8). En revanche, les peptides produits avec pHTP4 (DsbC) ont atteint les meilleurs rendements finaux en peptides pour 11 des 16 peptides, et parmi ceux-ci (à l’exception de T11) les rendements étaient supérieurs à 2 mg/L pour chaque peptide (4,6 mg/L en moyenne). Dans l’ensemble, les fusions DsbC (pour une expression périplasmique ou cytoplasmique) ont permis de produire 14 des 16 peptides de venin. En outre, un peptide (T7) n’a pu être produit que dans le périplasme, en utilisant le partenaire de fusion DsbC, à partir du vecteur pHTP4. Pour les peptides produits préférentiellement à partir d’autres vecteurs (T10, 12, 13, 14, 16), les rendements ne dépassent pas 2 mg/L, ce qui met en évidence l’expression robuste du vecteur pHTP4. Pour ces cinq peptides, les rendements les plus élevés ont été obtenus avec une expression cytoplasmique et un partenaire de fusion DsbC dans trois cas, suivis par une expression périplasmique avec le partenaire de fusion MBP dans deux cas. Dans la plupart des cas (sauf T13,T14 et T16), la fusion exportée dans le périplasme (pour la DsbC ou la MBP) a donné de meilleurs résultats que son équivalent cytoplasmique, ce qui indique qu’au moins une partie du repliement peut avoir lieu dans le périplasme et une partie peut avoir lieu ex vivo pendant la purification. Une démonstration frappante que DsbC (et probablement MBP) agit, en partie, comme un agent solubilisant passif à l’intérieur des bactéries est le fait que, alors que les rendements de fusion entre les constructions DsbC et DsbC muté étaient très similaires pour la plupart des peptides (Fig. 4), après clivage et récupération, le rendement global du peptide actif est en moyenne trois fois plus élevé dans le cas de la fusion DsbC redox-active qu’avec son homologue DsbC muté. Le détail des valeurs quantitatives a été résumé dans le fichier additionnel 7 : tableau S7.

La nature du résidu C-terminal (P1′) du site de clivage TEV n’affecte pas significativement l’efficacité du clivage

L’extrémité N-terminale de certains peptides venimeux peut contribuer à leurs sites de liaison aux récepteurs. Ainsi, il est possible que l’introduction d’un seul résidu supplémentaire à l’extrémité N-terminale du peptide puisse affecter son activité biologique . Le site de reconnaissance canonique de la protéase TEV requiert un résidu Gly ou Ser à son extrémité C-terminale (position P1′), ce qui laisse un résidu Ser ou Gly non natif à l’extrémité N-terminale du peptide cible après l’élimination de l’étiquette. Une étude précédente a suggéré que, à l’exception de la proline, toutes les chaînes latérales d’acides aminés pouvaient être logées dans la position P1′ d’un site de reconnaissance de la protéase TEV avec un faible impact sur l’efficacité du traitement. L’analyse a toutefois été réalisée dans des conditions optimales de tampon TEV. Afin d’être efficace en termes de temps, le pipeline de production de peptides de venin ne peut pas s’accommoder d’étapes supplémentaires telles que le changement de tampon dans des conditions TEV optimales. Ainsi, la capacité de la protéase TEV à agir dans le tampon d’élution IMAC (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazole 250 mM, DTT 0,1 mM, pH8), un tampon non optimal pour la protéolyse TEV, a été étudiée. La protéase TEVSH utilisée dans cette étude a été sélectionnée car elle est facile à surproduire et à purifier dans E. coli à des quantités très élevées (jusqu’à 100 mg/L de culture). Cependant, la spécificité de clivage de ce dérivé recombinant de la protéase TEV reste inconnue, notamment lorsque différents acides aminés occupent la position P1′ de son site de reconnaissance (Dr H. Berglund, communication personnelle). Ainsi, pour explorer l’activité de cette protéase TEVSH dans des conditions non optimales et lorsque la position P1′ du site de reconnaissance de la protéase est variée, 20 séquences de protéines de fusion test-cleavage ont été produites. Chaque protéine de fusion contenait un tag 6HIS N-terminal, une séquence de reconnaissance TEV interne, chacun contenant un acide aminé différent en position P1′, fusionné en C-terminal à une forme tronquée de la protéine de liaison ADN/ARN Kin17 d’Homo sapiens. Les protéines ont été purifiées et soumises au clivage de la protéase TEV dans les mêmes conditions que celles utilisées pour le clivage des 96 étiquettes de fusion (voir ci-dessus). Les données, présentées dans la figure 7, confirment les données recueillies précédemment et suggèrent que, à l’exception de la proline (la probabilité d’avoir une proline en position 1 des peptides de venin d’origine naturelle est faible), tous les autres résidus peuvent être logés en position P1′ du site de reconnaissance de la protéase TEV tout en conservant une certaine activité de clivage. Cependant, il faut prendre en considération les peptides avec un résidu N-terminal Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val ou Ile, où l’efficacité de clivage chute à 60% ou moins. Dans ces cas, il peut être nécessaire de trouver un compromis entre efficacité de clivage/rendement de production, selon le degré d’expression du peptide.