Le clonage à base de topoisomérase (clonage TOPO) est une méthode de clonage de l’ADN qui n’utilise pas d’enzymes de restriction ou de ligase, et ne nécessite aucune procédure post-PCR. Cela semble facile, non ? La technique repose sur la capacité fondamentale des paires de bases complémentaires adénine (A) et thymine (T) à s’hybrider et à former des liaisons hydrogène. Ce post se concentre sur le clonage TOPO à » extrémité collante » (également appelé TOPO-TA) ; cependant, la technique de clonage TOPO a également été adaptée au clonage à extrémité émoussée.
Alors, comment fonctionne le clonage TOPO ?
Comme illustré dans la figure ci-dessous, le surplomb » A » sur l’insert bleu du produit PCR provient de l’utilisation de la polymérase Taq pour l’étape d’amplification puisque la polymérase Taq laisse une seule désoxyadénosine (A) aux extrémités 3′ des produits PCR. Le « T » complémentaire dans la paire provient d’un squelette linéarisé par la topoisomérase I. L’ADN topoisomérase I (représentée par un nuage vert) fonctionne à la fois comme une endonucléase de restriction et comme une ligase en clivant et en rejoignant les extrémités super enroulées de l’ADN pour faciliter la réplication.
La technique TOPO utilise spécifiquement la topoisomérase I isolée du virus Vaccinia car cette enzyme reconnaît la séquence d’ADN 5′-(C/T)CCTT-3′ et digère l’ADN double brin au niveau de cette séquence. L’énergie de cette rupture est stockée sous forme d’une liaison covalente entre le brin 3′ d’ADN clivé et un résidu tyrosyle de la topoisomérase I (1). Si un groupe hydroxyle 5′ d’un brin d’ADN différent se présente, il peut attaquer cette liaison covalente joignant ainsi les deux brins d’ADN et libérant la topoisomérase (2).
De nos jours, les kits TOPO disponibles dans le commerce fournissent des vecteurs ou des bras de clonage avec des résidus 3′ de désoxythymidine (T) en surplomb qui sont liés de manière covalente à la topoisomérase. Les vecteurs de ces kits ont aussi souvent le site de la topoisomérase inséré dans une cassette de bêta-galactosidase, ce qui permet au chercheur d’effectuer un criblage bleu-blanc après transformation – l’auto-assemblage des extrémités du vecteur entraîne la production de colonies bleues qui n’ont pas besoin d’être prélevées et séquencées pour détecter les clones positifs potentiels. Une fois que vous avez introduit votre insert de surplomb en « A » à l’extrémité 3′, la magie du clonage TOPO se produit.
Procédure de base
Décomposons les étapes nécessaires au clonage TOPO :
1. Créez votre produit PCR : Concevez des amorces standard (pas besoin d’ajouter des sites de restriction uniques aux extrémités) et amplifiez votre séquence d’intérêt avec la Taq polymérase en utilisant votre protocole PCR préféré.
2. préparez la réaction de clonage TOPO : Mélangez ensemble le produit de la PCR et le vecteur TOPO.
3. Incuber 5 minutes à température ambiante : Vous pouvez placer votre réaction sur de la glace si vous prévoyez de transformer immédiatement OU vous pouvez conserver la réaction à -20C pendant la nuit.
4. Transformer la réaction de clonage TOPO dans des cellules compétentes : Vous pouvez utiliser votre protocole de laboratoire standard pour cela ; cependant, vous devez réduire votre temps d’incubation sur la glace à 5 minutes (l’incubation des 30 minutes complètes n’améliorera pas significativement l’efficacité de la transformation).
5. Sélectionnez et analysez 10 colonies blanches ou bleu clair : Vous pouvez confirmer la présence de votre insert par PCR, digestion de restriction ou séquençage.
Conseils pro
- Ne pas ajouter de phosphates 5′ à vos amorces PCR ; vous avez besoin de ce groupe hydroxyle libre !
- Vous pouvez inclure un temps d’extension supplémentaire après le dernier cycle de PCR pour vous assurer que le « A » est ajouté à tous les produits PCR.
- Gardez à l’esprit que la Taq polymérase a un taux d’erreur d’environ 1 sur 3 500 bases. Généralement, les polymérases dotées d’une fonctionnalité de relecture sont utilisées à la place de la Taq pour réduire le taux d’erreur ; cependant, les polymérases de relecture supprimeront également toutes les extrémités 3′ non appariées dans votre produit PCR. Si vous avez besoin de diminuer le taux d’erreur, veuillez utiliser l’une de ces méthodes pour vous assurer que votre insert conserve le surplomb 3′ A :
- Utiliser un mélange d’enzyme de relecture et de Taq, la Taq étant utilisée dans un rapport d’excès de 10:1.
- Purifier par gel votre produit PCR et l’incuber avec le tampon, la Taq et les dATPs à 72C pendant 10-15min.
- Lorsque vous mélangez le produit PCR avec le vecteur TOPO, vous pouvez vouloir ajouter du sel supplémentaire à votre réaction :
La topoisomérase I est libérée du vecteur lorsque le produit PCR et le vecteur se liguent ; cependant, elle peut potentiellement se relier à nouveau et entailler l’ADN nouvellement ligaturé. Le sel aide à empêcher la topoisomérase I de se lier à nouveau, ce qui permet d’obtenir davantage de molécules intactes. (Notez que la quantité de sel que vous ajoutez dépendra du fait que vous prévoyez de transformer votre réaction en E. coli chimiquement ou électro-compétent – un excès de sel provoque un arc électrique pendant l’électroporation, ce qui ferait échouer l’électroporation).
- Lors de l’incubation à température ambiante, il n’est pas recommandé de dépasser la limite de temps de 5 minutes (des efficacités de transformation inférieures ont été rapportées avec une incubation plus longue) ; cependant, vous pouvez avoir besoin d’incuber pendant 20-30 minutes si votre produit PCR est à une faible concentration ou si vous clonez un insert extrêmement grand.
- Puisque la réaction de ligature standard est assez rapide, assurez-vous de rester organisé et de préparer tout ce dont vous avez besoin pour l’étape suivante avant de procéder.
- Préchauffer votre plaque contenant des antibiotiques avant de plaquer votre transformation peut vous permettre de voir des colonies dans les 8 heures.
1. Shuman S. « La recombinaison médiée par l’ADN topoisomérase I du virus de la vaccine dans Escherichia coli est spécifique de la séquence. » Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID : 1658796. PubMed Central PMCID : PMC52876.
2. Nouvelle approche du clonage moléculaire et de la synthèse de polynucléotides utilisant l’ADN topoisomérase de la vaccine. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID : 7798275.
Ressources supplémentaires sur le blog Addgene
- Faire une mutagenèse dirigée par site par PCR
- Utiliser la mutatgenèse REPLACR pour générer facilement des insertions et des délétions dans un plasmide
- Apprendre comment vérifier votre plasmide
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