A gyulladáscsökkentő Lactobacillus reuteri BM36301 jellemzése és probiotikus előnyei idős egereken

A probiotikus tejsavbaktériumok jellemzése

Évek óta izolálunk tejsavbaktériumokat (LAB) különböző forrásokból, többek között emberekből, állatokból, növényekből és élelmiszerekből. Ezek a Benebios Mikroorganizmusok (BM) gyűjtemények több mint 500 törzsből állnak, amelyek probiotikus potenciálját már a kezdeti szűrések során feltártuk. Ebben a tanulmányban négy, székletmintákból származó humán kommenzális törzset választottunk ki és vizsgáltuk tovább részletesen (1. táblázat). A kifejezetten vizsgáltak két Lactobacillus reuteri törzs (BM36301 és BM36304), egy L. gasseri törzs (BM33601) és egy Bifidobacterium animalis subsp. lactis törzs (BM10307).

A baktériumokat általános probiotikus minősítésük szempontjából vizsgáltuk (1. táblázat). Először is, ezek a BM törzsek ellenállónak bizonyultak a savakkal (pH 2,5) és az epesókkal (0,3 %) szemben, 43 % és 98,5 % közötti túlélési arányt mutattak 1 órás 37 °C-os kezelés után, ami meglehetősen magas értékeket jelent . Ezután teszteltük az antimikrobiális aktivitást bélbaktériumokkal szemben. Míg a L. gasseri BM33601 minimális gátlást mutatott a tesztelő E. coli törzzsel szemben, addig az összes többi anyag határozott gátlási zónát képezett (0,5-3 mm távolság a LAB szélektől). Ezeket a gátló hatásokat általában a bakteriocinok, szerves savak (tejsav vagy ecetsav), hidrogén-peroxid vagy a LAB-ból származó etanol okozza. Végül megnéztük, hogy képesek-e in vitro kötődni a humán bélhámsejtekhez (IEC). Ehhez HT-29 humán vastagbélráksejteket tenyésztettünk fedőlemezeken 15 napig, és élő LAB-kultúrákat juttattunk rájuk 1 órára (Módszerek). Kiterjedt mosás után a megmaradt baktériumsejteket Gram-festéssel tettük láthatóvá, hogy mikroszkóp alatt megszámolhassuk őket . A L. reuteri BM36301 és BM36304 törzsek magas visszatartási pontszámot mutattak (5,5-7,4 baktérium per HT-29), míg a L. gasseri BM33601 közepes (1,7 baktérium per HT-29) és a B. animalis subsp. lactis BM10307 alacsony (0,3 baktérium per HT-29) pontszámot ért el. A LAB-ok erősebb tapadása az IEC-khez különösen fontos, mivel elég sokáig kell a bélnyálkahártya rétegén maradniuk ahhoz, hogy az előnyök kifejtsék hatásukat a gazdaszervezetre . Ezekből az elsődleges kísérletekből a két L. reuteri törzs nagyobb potenciált mutatott, mint minőségi probiotikum.

A TNF-α termelés tejsavbaktériumok általi in vitro szabályozása

A LAB-ok szűrését céloztuk meg a bélgyulladás elnyomására való képességük szempontjából. Ehhez egy olyan in vitro szövettenyésztési rendszert adaptáltunk, amelyben a humán myeloid sejtek (THP-1) TNF-α-t választanak ki Toll-szerű receptoraik (TLR) bakteriális lipopoliszacharid (LPS) általi aktiválására . Először is igazoltuk, hogy az 1 ml-es tenyészetben 5 × 104 THP-1 sejtek 150 ng/ml dózisú LPS-szel 3,5 órán keresztül kezelve általában 200-300 pg/ml TNF-α termelődését eredményezték (1a. ábra, 1. és 2. sáv). Ezután a 24 órán át növesztett baktériumtenyészetek felülúszóját összegyűjtöttük, vákuumszárítottuk, és a kondicionált táptalajt (CM) rekonstruáltuk (Módszerek). Ez a CM a LAB-tól és a tenyésztési körülményektől függően komplex aktivitásokat tartalmaz a TNF-α elnyomására és indukálására egyaránt. Valóban megfigyeltük, hogy a BM36304 és a BM36301 LPS nélküli CM-jei kismértékben termeltek TNF-α-t, de ez a mennyiség nem érte el az LPS-stimulált indukció 20 %-át (az adatok nem láthatóak). Végül minden egyes CM-et 5 %-ig adtunk THP-1 kultúrához (v/v) LPS jelenlétében (1a. ábra, 3-6. sáv). A TNF-α termelést LPS hatására (208 ± 49 pg/ml, 2. sáv) 40 %-ra nyomta el a L. reuteri BM36301-ből származó CM (90,90 ± 49,3 pg/ml, 3. sáv), és 52 %-ra a B. animalis subsp. lactis BM10307-ből származó CM (118,8 ± 19,0 pg/ml, 6. sáv). Szűrésünk során a TNF-α expressziójának 50 % közeli vagy annál kisebb mértékű elnyomását LPS-kezeléssel gyulladáscsökkentőnek tekintettük. A L. reuteri BM36304 és a L. gasseri BM33601 CM-jei azonban nem voltak képesek ilyen mértékben elnyomni a TNF-α termelést. Ezt az inert aktivitást úgy igazoltuk, hogy ezeket a CM-eket különböző tenyésztési körülmények között készítettük el (az adatok nem láthatóak).

A következőkben vizsgáltuk maguknak a baktériumsejteknek a TNF-α indukciós képességét, mivel a Gram-pozitív baktériumok sejtkomponensei gyulladásos válaszokat indukálhatnak . Ehhez a baktériumokat exponenciális fázisig (16 óra) növesztettük, majd ezeket az élő baktériumsejteket leszedtük, mostuk és többletben (250-szeres sejtszám) adtuk a THP-1 kultúrához. A baktériumsejtek anyagcsere-aktivitását a THP-1 táptalajhoz adott antibiotikumokkal minimalizáltuk. A 6 órás inkubáció után kvantitatív módon megmértük a szekretált TNF-α-t (1b. ábra). Bár mind a négy LAB-sejt TNF-α-t indukált, a BM36301 lényegesen kisebb mennyiséget (609 pg/ml) termelt, mint a többi: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) és BM10307 (7141 pg/ml). A 6 órás koinkubáció során megfigyeltük, hogy a THP-1 sejtek változó mértékű sejthalált szenvedtek az alkalmazott LAB-tól függően (Additional file 1). Leginkább a BM36301, a legalacsonyabb TNF-α indukáló, okozta a legkevesebb THP-1 elhalást (9,7%), míg a többi magasabb TNF-α indukáló törzs lényegesen nagyobb mértékű elhalást okozott (24-38%). Ezért nem arról van szó, hogy a BM36301 önmagában a THP-1 életképességének elvesztése miatt indukált alacsony TNF-α értéket. Szűrésünk során az 1000 pg/ml-nél nagyobb aktív TNF-α-termelésű LAB-okat proinflammatorikusnak tekintettük.

Összefoglalva, az in vitro immunmodulációs aktivitást a szuppresszív CM (BM36301 és BM10307) esetén gyulladáscsökkentőnek, az indukáló élő sejtek (BM36304, BM33601 és BM10307) esetén proinflammatorikusnak rendeltük. Mivel a BM10307 mindkét aktivitást mutatta, kettős funkcionalitással rendelkezőnek minősítettük (1c. ábra). Érdekes volt megfigyelni, hogy a két L. reuteri törzs eltérő aktivitást mutatott. A BM-gyűjteményeink széles skálájának kezdeti szűrése során a gyulladáscsökkentő törzsek meglehetősen ritkának bizonyultak, a felfedezési arányuk kevesebb mint 5 % volt (az adatok nem láthatóak). Emellett néhány törzs egyik aktivitást sem mutatta, így a “semleges” kategóriába tartoztak (az adatok nem láthatóak).

A CM-ekben lévő elnyomó molekulák hővel és tripszinnel szemben stabilak

Mivel a LAB-ból származó CM különböző bakteriális metabolitokból, valamint sejtkomponensekből áll, arra törekedtünk, hogy jobban megértsük a CM gyulladáscsökkentő jellegét. A TNF-α expressziója kvantitatív módon csökkent a L. reuteri BM36301 (2a. ábra) és a B. animalis subsp. lactis BM10307 (2b. ábra) CM-ek növekvő koncentrációjával. Érdekes módon a BM36301-ből származó CM kisebb mennyisége (0,5× input vagy 2,5 % v/v) ténylegesen tovább indukálta a TNF-α-t, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy ez a CM bizonyos mértékben TNF-α-indukáló anyagokat tartalmaz (2a. ábra, 2. és 3. sáv). Ennek ellenére a szuppresszív hatások nagyobb mennyiségű CM mellett dominánssá váltak, ami arra utal, hogy a gyulladáscsökkentő anyagok mennyiségileg additívak, és hogy a megfelelő receptorok a THP-1 sejtek felszínén elég nagy mennyiségben vannak ahhoz, hogy könnyen reagáljanak a növekvő CM-kezelésre. Összességében ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a CM-ek komplex jellegük ellenére is tartalmaznak a TNF-α szuppressziójáért felelős aktív metabolitokat.

A CM-ekben lévő gyulladáscsökkentő anyagok fizikai-kémiai jellemzőit vizsgáltuk tovább. Az egyes törzsekből származó CM-ek 10 perces forralása hatástalannak bizonyult a TNF-α gátló funkciójuk megváltoztatásában a natív CM-ekhez képest (2c. ábra, 3. és 4. sáv). Hasonlóképpen, a tripszin kezelés nem befolyásolta aktivitásukat (2c. ábra, 5. sáv). Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a fő gátló faktorok ezekben a CM-ekben nem fehérjék és nem hőérzékeny molekulák.

A TNF-α szabályozása egerekben probiotikus baktériumokkal

A LAB-szűrésünk alapján végzett in vitro TNF-α szabályozással kapcsolatban a végső kérdés az volt, hogy ez mennyire releváns az in vivo alkalmazásokkal kapcsolatban. Közvetlenül erre a kérdésre kerestük a választ a kiválasztott L. reuteri törzsek egér modellrendszerben történő alkalmazásával. Csoportonként 6 hím és 8 nőstény 20 hetes, beltenyésztett C57BL/6 egeret készítettünk. Ezután 20 héten keresztül az egyik csoportot a gyulladáscsökkentő BM36301-gyel, a másik csoportot a gyulladáscsökkentő BM36304-gyel, a kontrollcsoportot pedig dextrózzal kezeltük (Módszerek). Az állatokra gyakorolt stressz minimalizálása érdekében a LAB-kultúrákat ivóvízzel adtuk be, hogy a napi fogyasztási dózis egérenként 1 × 106 baktérium legyen. Standard étrendet is biztosítottunk, hogy az öregedési folyamat természetes legyen az időszak alatt. A 20 hetes inkubáció végén (összesen 40 hetes korban) elaltattuk az egereket, és vért vettünk le szérumkészítés céljából, hogy kvantitatív ELISA módszerrel citokineket és tesztoszteront mérhessünk. A boncolás során nem találtunk durva morfológiai eltéréseket.

Összefoglalva, a gyulladáscsökkentő BM36301 hatására a szérum TNF-α szintjének csökkenését figyeltük meg, a nőstényeknél kifejezettebb hatást észlelve. A pro-inflammatorikus BM36304 a TNF-α emelkedéséhez vezetett a férfiaknál, de a nőknél nem. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az in vitro szűrővizsgálataink jelentőséggel bírnak a TNF-α in vivo fenntartásával ezekben az egérkísérletekben.”

Az L. reuteri BM36301 fenntartotta a csökkent testsúlygyarapodást és a magas tesztoszteronszintet hím egerekben

Az öregedés számos egészségügyi probléma forrása az emberekben, beleértve a cukorbetegséget és az elhízást. Az ilyen öregedési problémák állatmodellben történő súlyosbítása érdekében gyakran alkalmaznak magas zsírtartalmú étrendet . Az ilyen felgyorsított kísérletek értelmezése azonban bonyolult lehet, mivel az emberekben az öregedést nem okozhatja célzottan magas zsírtartalmú étrend. Az összes egeret standard étrenddel tenyésztettük, hogy az öregedési folyamatuk a lehető legtermészetesebb legyen. A 20 hetes kortól kezdődő 20 hetes kísérleti idő alatt a kontrollcsoport hímjei körülbelül 8 g súlyt (7,83 ± 1,2 g), a kontrollcsoport nőstényei pedig körülbelül 5 g súlyt (4,8 ± 0,94 g) híztak. Figyelemre méltó volt, hogy a gyulladáscsökkentő BM36301-gyel etetett hímek súlygyarapodása 36 %-kal szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a kontrollé (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) (4a. ábra, 1. és 2. sáv). A BM36304-gyel kezelt hímek súlygyarapodása (7,53 ± 0,74 g) azonban nem különbözött szignifikánsan a kontrolltól (p = 0,67). A nőstény csoportok súlygyarapodása statisztikailag nem különbözött egymástól.

Egy másik jelentős különbség a BM36304-gyel kezelt hímek szérum inzulinszintje volt (4b. ábra). Míg a kontroll férfi csoportban 3,18 ± 0,65 ng/ml inzulin volt, addig a BM36304-zel táplált férfi csoportban 4,91 ± 0,63 ng/ml inzulin (p = 0,027). Ugyanakkor, összhangban azzal a megállapítással, hogy a súlygyarapodás ebben a csoportban nem sokban különbözött a kontrolltól (4a. ábra), nem figyeltünk meg szembetűnőbb hasi zsírfelhalmozódást a BM36304-kezelt hímeknél (az adatok nem láthatóak). Lehet, hogy 40 hetes korban az inzulinszpike nem okozott klinikailag nyilvánvaló cukorbetegséget az egerekben, de a betegség kifejezettebbé válhatott, ha az egerek tovább öregedtek. A nőstény csoportok közötti inzulinváltozások nem különböztek szignifikánsan egymástól.

Végezetül a hímek tesztoszteronszintjére összpontosítottunk. Amint a 4c. ábrán látható, a gyulladáscsökkentő BM36301-zel táplált hímek szérumtesztoszteronszintje szignifikánsan magasabb maradt (5,18 ± 0,87 ng/ml), mint a kontrollcsoporté (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). A BM36304-kezelt csoport azonban statisztikailag nem különbözött (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) a kontrolltól. A tesztoszteron eredmények további megértése érdekében megvizsgáltuk az egyes egerek heréit. A BM36301-zel táplált hímek párosított heréinek súlya 0,579 ± 0,075 g volt, 10 %-kal nagyobb, mint a kontrollé (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Figyelembe véve a BM36301 csoport kisebb súlygyarapodását (4a. ábra), a heréknek ez a méretbeli különbsége még nyilvánvalóbb; a kontroll csoport heresúlyának és testsúlygyarapodásának aránya (TW/WG) csak 67 %-a volt a BM36301 csoportéhoz képest. A herékből származó szövetek mikroszkopikus különbségeit azonban nem tudtuk megfigyelni, mint például a szemcsés tubulusok átmérőjét a két csoport között (156,03 ± 6,65 μm a kontroll vs. 153,95 ± 18,66 μm a BM36301-kezelt hímeknél, p = 0,51). Más vizsgálatokat, például a spermatogenezis vagy a Leydig-sejtek területének összehasonlítását nem végeztük el.

Összefoglalva, a gyulladáscsökkentő BM36301 segített a hímeknek fenntartani az alacsonyabb súlygyarapodást, nagyobb herékkel és több tesztoszteronnal, ahogy öregedtek. Az idősödő hímek csökkent tesztoszterontermelését a herék korfüggő elváltozásaival javasolták összefüggésbe hozni, feltehetően gyulladásos inzultus következtében . Eközben a pro-gyulladásos BM36304 az inzulin növekedését váltotta ki, bár a súlygyarapodás vagy a tesztoszteron változása nélkül a hímek körében. Figyelemre méltó, hogy egyik baktériumtörzs sem volt jelentős hatással ezekre a testméretekre a nőstény egereknél.

Egészséges női bőr a gyulladáscsökkentő BM36301-től

A bizonyos probiotikumok egyik érdekes tulajdonsága, hogy az immunszabályozástól függő módon elősegíthetik a bőr egészségét . Mivel a BM36301 in vitro és in vivo is gyulladáscsökkentő hatást mutatott, feltettük a kérdést, hogy ez a törzs képes-e ilyen egészségügyi előnyöket kiváltani a bőrben. A kezelés 18. hetében minden csoportból 2 egéren leborotváltunk egy területet, és 1 hét múlva megvizsgáltuk őket. Érdekes módon a BM36301-zel táplált nőstény egereknél a borotvált területen a szőr gyorsabb újranövekedést mutattak, bár nem teljes gyógyulást (5a. ábra). Ezzel szemben a kontroll vagy a BM36304 csoportok nem mutattak ilyen gyors helyreállási ütemet. A kezelt hímek egyike sem mutatott a kontrollnál megkülönböztethetően gyorsabb szőrvisszanövekedést, ami azt jelzi, hogy ez a gyorsabb szőrnövekedés csak a nőstényeknél lehet nyilvánvaló. A bőr egészségének értékelésére szolgáló másik mérőszám a szőrzet fényességének vizsgálata. Érzékszervi vagy fénymérő mérésekkel azonban nem tapasztaltunk jelentős különbségeket az egyes csoportok között, főként a kontrollok viszonylag fényes szőrzetének állapota miatt (az adatok nem láthatóak).

A bőr egészségét tovább értékeltük a bőr keresztmetszeteinek mikroszkóp alatti vizsgálatával, miután Hematoxilin és Eozin festést végeztünk. Amint az 5b. és c. ábrán látható, azt találtuk, hogy a BM36301-zel kezelt nőstény egereknél magasabb volt a bőr alatti szőrtüszők (HF) száma, mint a kontroll nőstény egereknél. A HF-számok mikroszkópos nézetenként 400×-os felbontásnál 3,50 ± 0,52 volt a kontroll nőstény csoportban, míg a BM36301-zel táplált nőstényeknél 4,80 ± 0,61, ami jelentős különbség (p = 0,023). A BM36304-kezelt nőstények azonban csak csekély változást mutattak (4,15 ± 1,73, p = 0,55 vs. kontroll). A szőrtüszők részletesebb elemzése során azt találtuk, hogy a BM36301-zel kezelt nőstények a kontrollnál valamivel aktívabb szőrciklus-szakaszokat mutattak (anagén + katagén: telogén 81:19 volt a kontrollnál vs. 95:5 a BM36301-zel kezelt nőstényeknél). Eközben a hím csoportok HF-számai nem sokban különböztek egymástól (5b. ábra). Végül felmértük a bőr vastagságát is, amelyet az epidermisztől a panniculus carnosusig mértünk (5c. ábra, 1. kiegészítő fájl). Nem találtunk nagy különbséget a mélységben a kontroll és a BM36301-kezelt nőstények között. A BM36301-zel kezelt egerek bőrrétegei azonban kismértékben mélyebbnek bizonyultak, mint a kontrollé, és a BM36301-zel kezelt egerek zsírszövete sekélyebb volt, mint a kontrollé. A bőr alatti HF-ek többsége a dermiszben volt megtalálható.

Ezek a megfigyelések összességében arra utalnak, hogy a gyulladáscsökkentő BM36301-gyel történő kezelés elősegítette az egészségesebb bőr kialakulását, amit a szőrzet újranövekedése és a nőstények HF-száma is bizonyít. A bőrminták mikroszkópos különbségei a kontroll és a BM36301 csoport között azonban meglehetősen marginálisnak tűntek. Ezek a bőregészségügyi előnyök a férfiaknál nem voltak megfigyelhetők. Emellett a gyulladáscsökkentő BM36304 a kísérletek idején nem okozott semmilyen káros hatást a bőrön.