A kromoszómaanalízis és a CMA klinikailag hasznos diagnosztikai eszközök a kromoszóma-rendellenességek kimutatására az egész emberi genomban. Jelenleg a CMA-t az értelmi fogyatékosság és a veleszületett rendellenességek első számú vizsgálataként ajánlják, felváltva a kromoszómaanalízis korábbi szerepét. Ebben a tanulmányban összehasonlítottuk a kromoszómaanalízis és a CMA eredményeit 3710 esetben, hogy meghatározzuk a kromoszómaanalízis elvégzésének értékét.
- A mozaikosság maximális kimutatása a CMA és a hagyományos citogenetikai analízis együttes alkalmazásával
- A kromoszóma-analízis kromoszómaszerkezeti információt szolgáltat, de a CMA nem nyilvánvaló
- Normális CMA-vizsgálattal rendelkező, látszólag kiegyensúlyozott átrendeződések
- Evidence-based strategy for efficient detection of chromosome abnormalities
A mozaikosság maximális kimutatása a CMA és a hagyományos citogenetikai analízis együttes alkalmazásával
A tanulmány szerint a betegek 1,2%-ánál (43/3 710) volt mozaikos lelet. A mozaikosságot csak kromoszómaelemzéssel az esetek 39%-ában észlelték, mivel vagy nagyon alacsony (<10%) vagy nagyon magas (>80%) volt az abnormális sejtek aránya, míg az esetek 12%-ában csak a CMA-val mutatták ki. Az esetek fennmaradó 49%-át mind a CMA, mind a kromoszómaelemzéssel kimutatták.
A mozaikizmus CMA-val és a kromoszómaelemzéssel történő kimutatása a technológia és az elemzett sejtpopuláció különbsége miatt különbözik. A CMA a perifériás vér összes sejtmagvú sejtjéből kivont DNS-t elemzi, beleértve több sejtvonalat is. Ezzel szemben a kromoszómaelemzést elsősorban a fitohemagglutininnel stimulált T-limfocitákon végzik. Tanulmányok kimutatták, hogy a CMA érzékenyebb lehet, ha a rendellenes sejtek nem reagálnak a mitogénekre és/vagy a rendellenességek ritkák vagy hiányoznak a T-sejtekben, mint például a Pallister-Killian-szindróma esetén.5,6,6 Öt esetben a 8, 9, 14 és 22 kromoszómát érintő mozaikos triszómiát csak CMA-val mutattak ki.
Noha a CMA könnyen kimutatja a 30%-os vagy annál nagyobb mértékű mozaikosságot, a <10%-os mozaikosság rutinszerű kimutatásában korlátozott.6,13,14 Más tömbplatformok, például az egynukleotid-polimorfizmus tömbök a B-allél frekvenciákból nyert információk alapján jobban képesek lehetnek a mozaikizmus kimutatására.15,16,16 A kromoszómaelemzés nagyszámú sejt egyedi vizsgálata révén képes kimutatni az alacsony szintű mozaikosságot. A 20 sejtet vizsgáló standard kromoszómavizsgálatok 95%-os megbízhatósági szinten kizárják a 14%-os mozaikosságot. Több sejtet lehet vizsgálni, ha egy vagy két abnormális metafázisú sejtet azonosítanak. Sok egyedi sejt elemzése azonban idő- és munkaigényes. Mozaikosság gyanúja vagy megerősítése esetén a FISH segítségével több száz egyedi interfázisú sejtet lehet megvizsgálni a mozaikosság szintjének meghatározásához; a FISH viszonylag kevésbé időigényes, mint a kromoszómaelemzés.
A CMA által elszalasztott rendellenességek – a látszólag kiegyensúlyozott átrendeződések kivételével – az összes eset <0,2%-át teszik ki ebben a vizsgálatban ( 2. táblázat ). A legtöbb esetet a CMA nem tudta kimutatni, mivel az abnormális sejtek aránya a CMA kimutatási határa alatt volt (<10%). A 2. és 3. esetben a nagyon alacsony szintű mozaikizmus, a 4. esetben pedig a kizárólag pericentromerikus ismétlődő szekvenciákat tartalmazó kis markerkromoszóma klinikai jelentősége nem világos. A fennmaradó, a CMA által kihagyott rendellenességek fenotípusos eltérésekkel társulnak. Nem világos, hogy az 5. esetben a tenyésztett sejtek 30%-ában észlelt rendellenességet miért hagyta ki a CMA, de feltehetően ez annak köszönhető, hogy a rendellenes sejtek felülreprezentáltak a T-sejtekben. Az azonos régiót érintő genomiális nyereséggel és veszteséggel rendelkező két különböző sejtvonal jelenléte az adott régió tekintetében nettó genomiális egyensúlyt eredményezett, így a CMA nem észlelte azt, amint azt a 6. eset mutatja.
A mozaikosság CMA-val történő észlelése a deléció vagy duplikáció várható logaritmusától való eltérésen alapul mozaikosság nélkül. A feltételezett mozaikosságot tenyésztett sejteken végzett kromoszómaelemzéssel vagy FISH-elemzéssel kell megerősíteni, lehetőleg vérkenet felhasználásával. Az itt vizsgált 11 esetben a CMA képes volt kimutatni a kromoszóma-rendellenességet, de nem tudta kimutatni, hogy az eset mozaikos volt, mivel a normális sejtek aránya alacsony volt, vagy egy izodicentrikus kromoszóma jelenléte szegmentális tetraszómiához vezetett. Például két esetben a CMA a 18-as kromoszóma összes szondája által kimutatott kópiaszám-gyarapodást mutatott ki ( 2. ábra ), ami 18-as triszómiára utal. Valójában a kromoszómaelemzés azt mutatta, hogy az egyik esetben az összes sejtben 18-as triszómia volt ( 2a. ábra ), míg a másik esetben a sejtek 80%-ában 18-as triszómia mozaikizmus volt ( 2b. ábra ). Ezenkívül, ha két vagy több abnormális sejtvonal ugyanazt a régiót érinti, amint azt a 2c. ábrán bemutatott eset példája mutatja, a kromoszóma- és/vagy FISH-elemzés elengedhetetlen a kromoszóma-rendellenességek helyes értelmezéséhez.
A kromoszóma-analízis kromoszómaszerkezeti információt szolgáltat, de a CMA nem nyilvánvaló
A CMA nagyon megbízható információt nyújt arról, hogy a kópiaszám-nyereség és veszteség jelen van-e, de nem nyújt pozíciós vagy orientációs információt. Vizsgálataink azt mutatták, hogy a rendellenes CMA esetek 18%-ában mutatkoztak szerkezeti rendellenességek. Az ebben a vizsgálatban azonosított strukturális átrendeződések fele kiegyensúlyozatlan transzlokáció/inserció, egyharmada egyéb strukturális változás, mint például gyűrűs kromoszómák, marker kromoszómák, izokromoszómák és izodicentrikus kromoszómák, a fennmaradó 15% pedig komplex átrendeződés. Tekintettel arra, hogy e szerkezeti aberrációk többsége szubtelomer régiókat érint, a terminális kópiaszám-változások nagyobb valószínűséggel járnak további szerkezeti eltérésekkel.17 Általánosságban elmondható, hogy mind a kromoszómaelemzés, mind a FISH-elemzés képes a transzlokációk, inzerciók, izokromoszómák és markerek azonosítására, az egyes módszerek eltérő erősséggel. Bár a FISH túl kicsi változásokat képes kimutatni ahhoz, hogy kromoszómaelemzéssel kimutatható legyen, a kromoszómasávok mintázatának elemzése további információt nyújt az érintett régiókról. Összetett átrendeződések esetén a komplex szerkezeti változások teljes meghatározásához kombinált FISH és kromoszómaelemzésre lehet szükség. Ettől a kivételtől eltekintve a CMA által talált kóros leletet követő FISH-analízis általában elegendő ahhoz, hogy információt nyújtson a kópiaszám-változás jellegéről.
Egyes kromoszómaátrendeződések még a CMA és a FISH után is kimaradhatnak. Például a 9. esetben a CMA egy 2q interstitialis deléciót mutatott ki ( 1a. ábra ). Kromoszómaelemzés nélkül az átrendeződés egyszerű egyszeri deléciónak tűnik, még a megerősítő FISH-elemzés után is. A kariotípus vizsgálata azonban abnormális 2. kromoszómát mutatott ki, a 17q23.1q23.3-ból a 2p11.2 sávba egy szegmens beillesztésével. Ezenkívül a 2. kromoszóma a beillesztett 17q szegmenssel pericentrikus inverziót is mutat a 2p12 és a 2q31.1 között. A 2q31.1-es kromoszómán a CMA által kimutatott deléció valószínűleg a 2. kromoszóma hosszú karján lévő inverziós törésponton vagy annak közelében keletkezett. Összefoglalva, a 9. esetnek komplex átrendeződése volt, beleértve egy CMA-val kimutatható, de kromoszómaelemzéssel nem látható deléciót a 2q-ban, valamint egy 2. és 17. kromoszómát érintő inszerciót és inverziót, amely kromoszómaelemzéssel kimutatható, de CMA-val nem. Hasonlóképpen, a 10. esetben négy kromoszómát érintő de novo átrendeződések voltak, beleértve a 2q14.2q24.1 szegmens beillesztését a 6. kromoszóma rövid karjába, amely szintén paracentrikus inverzióval rendelkezik, valamint egy reciprok transzlokációt a 12. és 18. kromoszóma között. A 2. és 6. kromoszómában lévő töréspontok közelében CMA-val másolatszám-veszteséget azonosítottak ( 1b. ábra ). A helyes diagnózishoz a CMA és a kromoszómaelemzés kombinációja szükséges.18
A kromoszóma szerkezeti átrendeződések azonosítása nélkülözhetetlen a család genetikai tanácsadásához. A CMA-val kimutatott genomiális egyensúlytalanságok az egyik szülőnél kiegyensúlyozott transzlokáció vagy inszerció kiegyensúlyozatlan szegregációs termékéből adódhatnak, és ezért indokolja a szülői vizsgálatok elvégzésének határozott ajánlását. Ezenkívül a kromoszómaszerkezeti információk iránymutatást adnak arra vonatkozóan, hogy mely szülői vizsgálatok elvégzése javasolt. Az olyan átrendeződések esetében, amelyek valószínűleg kiegyensúlyozott átrendeződés termékei, a szülői CMA helyett szülői FISH-t vagy kromoszómaelemzést kell végezni.
Normális CMA-vizsgálattal rendelkező, látszólag kiegyensúlyozott átrendeződések
Ebben a vizsgálatban 30 esetben (~0,8%) mutattak ki egyéb kromoszóma-rendellenesség nélküli, egyetlen látszólag kiegyensúlyozott transzlokációt vagy inverziót kromoszómaelemzéssel. Arról számoltak be, hogy a többszörös veleszületett rendellenességgel/mentális retardációval és de novo látszólag kiegyensúlyozott transzlokációval rendelkező betegek ~40%-ánál a töréspontok közelében vagy a töréspontokhoz nem kapcsolódóan rejtélyes rendellenességek vannak, amelyek CMA-val könnyen kimutathatók.19,20 A CMA azonban ebben a 30 esetben nem mutatott ki a töréspontok közelében kópiaszám-változást. Ehhez a megfigyeléshez több tényező is hozzájárulhat. A legtöbb átrendeződés az esetek egy részhalmazának szülői vizsgálatai alapján öröklődött, ami azt jelenti, hogy nagyobb valószínűséggel “valóban” kiegyensúlyozottak. Ezenkívül a Robertson-transzlokációkat, amelyek általában nem eredményeznek kópiaszám-változást az euchromatinban, bevonták ebbe a vizsgálatba, de a publikált tanulmányokból kizárták. Ezenkívül a töréspontok melletti kis kriptikus deléciók/duplikációk kimaradhatnak, mivel a legtöbb ilyen esethez használt tömbök célzottak voltak, és nem rendelkeztek megfelelő genomi felbontással az egyensúlytalanság kimutatásához.
Noha a kiegyensúlyozott átrendeződések többsége jóindulatú, a de novo átrendeződések magasabb betegségkockázattal járnak kriptikus deléció vagy duplikáció, gén vagy enhancer zavar, pozícióhatás vagy epigenetikai hatás miatt. A súlyos veleszületett rendellenesség kockázata a de novo reciprok transzlokációk és inverziók esetében 6,7%.21 A kockázat várhatóan alacsonyabb azokban az esetekben, ahol a CMA a teljes genom array segítségével normális. Ezért az ebben a vizsgálatban kimutatott egyszerű kiegyensúlyozott átrendeződések kisebb valószínűséggel okozzák a betegek fenotípusát.
Evidence-based strategy for efficient detection of chromosome abnormalities
Hogy meghatározzuk, hogy a kromoszóma-rendellenességek klinikai diagnosztizálásához szükséges-e és mikor kell kromoszómaelemzést végezni, megvizsgáltuk a CMA-val és kromoszómaelemzéssel egyszerre vizsgált esetek eredményeit. A kromoszómaanalízissel kimutatott, de a CMA által teljesen kihagyott kromoszóma-rendellenességeket az esetek ~1%-ában figyeltük meg, beleértve a látszólag kiegyensúlyozott átrendeződéseket 0,8%-ban és a mozaikizmussal összefüggő egyensúlytalanságokat 0,16%-ban. Ezenkívül a kromoszómaanalízis a kóros CMA-eredményekkel rendelkező esetek 18%-ában megkönnyítette a kromoszóma szerkezeti átrendeződések kimutatását.
Noha a CMA információt szolgáltat a kópiaszám-változásról és a mozaikosságról, csak a kromoszómaanalízis vagy a FISH szolgáltatja az e kópiaszám-változásokhoz kapcsolódó kromoszóma szerkezeti információkat, és azonosítja a CMA által nem kimutatott mozaikosság egyes eseteit. A FISH előnye a kromoszómaanalízissel szemben, hogy kis (<3-10 Mb) kópiaszám-változások is kimutathatók, és nagy számú sejtmag gyorsan elemezhető, ami különösen hasznos a mozaikosság értékeléséhez. Ezért egy kóros CMA után először FISH-analízist lehet alkalmazni a kópiaszám-változásokhoz kapcsolódó strukturális átrendeződések kimutatására, a mozaikosság megerősítésére és a kóros sejtek százalékos arányának meghatározására. Ha FISH-vel inszerciókat vagy transzlokációkat észlelnek, az érintett kromoszómák meghatározásához kromoszómaanalízisre lehet szükség. A standard kromoszómaanalízis helyett, amely két tenyészet 20 metafázisú sejtjét vizsgálja, egy tenyészet öt sejtjének kisméretű kromoszómaanalízise elegendő erre a célra. Ez a stratégia néhány ritka komplex átrendeződés kivételével minden szerkezeti változást kimutatna.
A CMA-val normális eredményt adó esetekben teljes kromoszómaanalízis elvégzése megfontolandó, ha a betegnél többszörös veleszületett anomáliák, diszmorfikus jellegzetességek és/vagy kromoszómaszindrómára emlékeztető szellemi visszamaradottság, vagy potenciális mozaikizmusra utaló klinikai megnyilvánulások, például véletlenszerűen eloszló vagy a Blashko-vonalakat követő pigmentációs rendellenességek és értelmi fogyatékossággal társuló növekedési aszimmetria fordul elő. E vizsgálat alapján az esetek ~1%-ában lenne informatív kromoszómaeredmény, de <0,001 esetben (3/3.710) lenne klinikailag jelentős lelet.
Összefoglalva, vizsgálatunk tovább erősíti, hogy a kromoszómaanalízissel kimutatható kromoszóma-rendellenességek szinte mindegyikét kimutatja a CMA, ami alátámasztja azt az ajánlást, hogy a CMA legyen az elsőrendű vizsgálat. A hagyományos citogenetikai analízis azonban továbbra is hasznos marad a mozaikosság kimutatására és a strukturális átrendeződések jellemzésére.