Tetraciklin indukálható rendszereket széles körben használtak élesztőben a génátírás szabályozásának tanulmányozására egyes sejtekben15,16,17,18,19,20,21,22. Az rtTA ebben a kontextusban történő felhasználásához két erős doxiciklinre reagáló promótert hoztunk létre három (PTET3) vagy négy (PTET4) rtTA-kötőhellyel, és az optimalizált rtTA-M2 variánst7 használtuk az élesztő-erősített zöld fluoreszcens fehérje (yeGFP)23 expressziójának szabályozására ezekről a promóterekről (1a. ábra). Az rtTA/PTET-yeGFP expressziós kazettát egyetlen példányban integráltuk az élesztő genomba. Az M2 változat megegyezik a ClonTech Tet-ON Advanced expressziós rendszereiben található változattal.
A rtTA-M2 jelentős aktivitással rendelkezik doxiciklin indukció nélkül.
(a) A kísérleti elrendezés vázlata, ahol az rtTA-M2-t a PMYO2 vagy PTDH3 konstitutív promóterről, a yeGFP-t pedig tet-rezisztens promóterről fejezzük ki. (b) A PMYO2 vagy PTDH3 által expresszált rtTA-M2 doxiciklin dózisfüggő aktiválása (három technikai ismétlés átlaga +/- s.e.m.). Az AutoFL vad típusú BY4742 élesztősejtek. (c) A PMYO2-rtTA rendszert hordozó sejtekből kapott egysejtű fluoreszcencia eloszlásai különböző doxiciklin-koncentrációk mellett. A szürke fokozatosan sötétebb árnyalatai 0,25, 1, 5 és 100 μg/ml doxiciklinnek felelnek meg. AutoFL vad típusú BY4742 élesztősejtek (d) Vad típusú BY4742 élesztősejtek vagy PMYO2-rtTA rendszert hordozó, nem indukált sejtek egyesített fénymező-fluoreszcencia képei.
A célgének szivárgó átírásának problémája különösen mélyreható, ha az rtTA magas szinten expresszálódik. Ezt szemlélteti az 1b. ábra, amely a PTET3 doxiciklin dózisválasz görbéket mutatja, amikor az rtTA-M2 az erős PTDH3 promóterről expresszálódik. A fluoreszcencia nagyon magas volt, amikor a sejteket telítődő mennyiségű doxiciklinnek tettük ki. Mindazonáltal a PTET3 promóterből történő szivárgó transzkripció miatt a rendszer dinamikai tartománya meglehetősen gyenge volt, a maximális expresszió ~17-szer nagyobb volt teljes indukció esetén, mint doxiciklin hiányában.
Egy olyan modellel összhangban, amelyben a transzaktivátor jelentős aktivációs potenciállal rendelkezik indukálatlan állapotában, az rtTA-M2 gyenge PMYO2 promóterből történő expressziója jelentősen csökkentette a fluoreszcenciát doxiciklin hiányában. Bár teljes telítettség nem volt megfigyelhető ebben a rendszerben, a szivárgó expresszió csökkentése a dinamikai tartomány drasztikus javulását eredményezte, és a doxiciklinnel történő indukció a fluoreszcencia ~200-szoros növekedését eredményezte. E javulás ellenére azonban mind az áramlási citometriai adatok (1c. ábra), mind a fluoreszcens mikroszkópiás adatok (1d. ábra) azt jelezték, hogy az indukálatlan rtTA-M2 még akkor is jelentős riportergén-expressziót okoz, ha a transzaktivátor gyenge promóterről fejeződik ki.
A PTDH3-rtTA-M2 rendszert hordozó tizenkét klón kezdeti tesztelése során szerencsésen felfedeztük, hogy egyikük váratlanul alacsony fluoreszcenciát bocsátott ki doxiciklin hiányában, de teljes indukció esetén szinte normális fluoreszcenciát (2a. ábra). Az ezt követő szekvenálás egyetlen nukleotid mutációt azonosított, guaninból timinné, amely egy glicint (GGG) valinre (GTG) cserél a transzaktivátorfehérje 72-es maradékában. A Western blot elemzés azt mutatta, hogy ez a csere nem befolyásolja a fehérje mennyiségét (2a. ábra, Insert, a részleteket lásd az S1. kiegészítő ábrán), és az expressziós rendszer rekonstruálása megerősítette, hogy az egyetlen guanin-timin mutáció felelős a doxiciklin dózisválaszban megfigyelhető változásokért (az adatok nem láthatóak).
A 72-es glicin mutációja az rtTA-M2-ben az alapaktivitást kimutathatatlan szintre csökkenti.
(a) PTDH3-ból kifejezett rtTA-M2 variánsok doxiciklin dózisfüggő aktiválása (három technikai ismétlés átlaga +/- s.e.m.). Az AutoFL vad típusú BY4742 élesztősejtek. A betétben egy western blot (kivágva), amely összehasonlítja az rtTA-M2 és a G72V mutáns fehérjebőségét. Minden mintát azonos kísérleti körülmények között készítettünk és futtattunk. (b) A PTDH3-rtTA(G72V) rendszert hordozó sejtekből különböző doxiciklin-koncentrációk mellett kapott egysejtű fluoreszcencia eloszlásai. Az AutoFL vad típusú BY4742 élesztősejtek. A szürke fokozatosan sötétebb árnyalatai 1, 2,5, 5 és 100 μg/ml doxiciklinnek felelnek meg. (c) PTDH3-rtTA-M2 vagy PTDH3-rtTA(G72V) rendszert hordozó, nem indukált sejtek egyesített fénymező-fluoreszcencia képei. (d) A TetR dimer rajzos ábrázolása, amelyben az egyes protomerek különböző színűek (sárga és türkizkék). A másodlagos szerkezet fel van címkézve, a G72 gömbként látható.
A PTDH3-rtTA-M2(G72V) rendszer figyelemre méltó dinamikai tartományt mutat, és a fluoreszcencia intenzitása ~500-szoros növekedést mutatott, amikor a sejteket magas doxiciklinnel indukáltuk, szemben az indukció nélkülivel (2b. ábra). Ezenkívül az áramlási citometriával detektált fluoreszcencia emisszió megkülönböztethetetlen a sejtek autofluoreszcenciájától doxiciklin hiányában, és a változat megőrzi az eredeti transzaktivátor fokozatos indukciós válaszát. Sőt, az indukálatlan rtTA-M2(G72V) törzsből származó riporter-expresszió fluoreszcens mikroszkópiával még olyan műszeres beállítások mellett sem volt kimutatható, ahol az indukálatlan rtTA-M2 törzs erős telítődő jelet adott (2c. ábra).
Hogy betekintést nyerjünk abba, hogy egyetlen mutációnak milyen drasztikus hatása lehet az rtTA-M2(G72V) dinamikai tartományára, megvizsgáltuk, hogy a fehérje háromdimenziós szerkezetének összefüggésében hol található a maradék. Az rtTA-M2 vagy más rtTA-változatok szerkezetét nem oldották meg. Mivel azonban az rtTA TetR doménjének 207 aminosavából 203 megmaradt7 , a TetR24 nagy felbontású szerkezete betekintést nyújt az rtTA DNS-kötő doménjének szerkezetébe. A TetR szerkezetében a 72-es glicin-maradék egy rugalmas hurokhoz tartozik, amely az α4 és α5 α-hélixek között található, a represszor DNS-kötő domén (α1-α3) és a tetraciklin-kötő régió (α5-α9)24,25 közötti régióban (2d. ábra). Ez arra utal, hogy a szubsztitúció, amely egy nem poláris oldalláncot vezet be, hosszú távú konformációs változásokat vált ki, amelyek végső soron befolyásolják a transzaktivátor aktivitását, feltehetően a tercier szerkezetének merevítése révén.
Ezért a hipotézis vizsgálatához két további változatot hoztunk létre, amelyekben a glicin-maradékot alaninná vagy prolinná mutáltuk. Ezek a mutációk megőrzik a valin-maradék nem-poláris jellegét, de különböző méretű oldalláncokat vezetnek be. Arra számítottunk, hogy az alanin egyetlen metil oldallánca kevésbé lesz hatékony a nem indukált aktivitás megakadályozásában, mint a prolin nagy, ciklikus oldallánca. Létrehoztunk egy β-ösztradiollal indukálható expressziós rendszert26 is, hogy az rtTA-M2 expresszióját közvetlenül kontrollálhassuk, és az rtTA DNS-kötő képességének fokozása érdekében egy extra TetR-kötőhellyel, a PTET4-gyel ellátott promótert használtunk. Az expressziós rendszert vázlatosan a (3a. ábra) szemlélteti. Western blot analízissel megerősítettük, hogy a négy rtTA változat hasonló szinten expresszálódik teljes β-ösztradiol indukció esetén (3b. ábra, a részleteket lásd a Kiegészítő S2. ábrán), és hogy az rtTA-t nélkülöző törzs fluoreszcenciája a vad típusú BY4742 élesztőtörzstől megkülönböztethetetlen riporter-expresszióval rendelkezik, ami azt mutatja, hogy a PTET4-nek nincs háttér riporter-expressziója (Kiegészítő ábra. S3.
A 72-es maradéknál lévő nem poláris oldalláncok a bázisaktivitás kulcsfontosságú meghatározói.
(a) A génhálózat sematikus ábrája, ahol az rtTA-M2 variánsok egy β-ösztradiol indukálható promóterről, a yeGFP pedig egy tet-rezisztens promóterről fejeződik ki. (b) Western blot (kivágva), amely összehasonlítja mind a négy rtTA-variáns fehérjebőségét 1000 nM β-ösztradiollal indukált vagy indukció nélküli indukció esetén. Minden mintát azonos kísérleti körülmények között készítettünk és futtattunk. (c) Összevont fénymező-fluoreszcencia képek mind a négy rtTA variánsról 1000 nM β-ösztradiollal indukálva, doxiciklin indukció nélkül. (d) Az rtTA-variánsok alapaktivitása a β-ösztradiolfüggő expressziós szint függvényében (három technikai ismétlés átlaga +/- s.e.m.). A betétben a különböző rtTA-variánsok riporter-expressziójának hisztogramjai. (e) Az 1000 nM β-ösztradiolban ubiquitikusan expresszálódó rtTA-M2 variánsok doxiciklin dózisfüggő aktiválása (három technikai ismétlés átlaga +/- s.e.m.).
Amint az várható volt, az alaninvariáns nagyobb szivárgási expressziót mutatott, mint a valinvariáns, a prolinváltozat fluoreszcenciája pedig áramlási citometriával mérve nem különbözött a sejtek autofluoreszcenciájától. Ez nyilvánvaló a fluoreszcens mikroszkópiás felvételekből, amelyeket olyan műszeres beállításokkal kaptunk, ahol az eredeti M2 variánst hordozó törzs erős fluoreszcens jelet ad teljes β-ösztradiol indukció mellett (3c. ábra), valamint az áramlási citometriás fluoreszcencia-mérésekből változó β-ösztradiol indukció mellett (3d. ábra).
Megfigyelhető, hogy az aminosavcserék, amelyek jelentősen csökkentik a bazális riportergén expresszióját, minimális hatással vannak az rtTA transzkripciós aktivációjára teljes β-ösztradiol és doxiciklin indukció mellett. Ezt szemlélteti a 3E. ábra, amely a négy G72-M2 variáns dózis-válasz görbéit mutatja, amelyeket a doxiciklin teljes β-ösztradiol indukciója mellett mértünk. Az aminosavcserék azonban befolyásolják a doxiciklin-érzékenységet. Kísérleteinkben (3e. ábra) az M2 variánsnak volt a legmagasabb az érzékenysége ~0,06 μg/ml-es félmaximális hatásos koncentrációval (EC50), míg az alanin variáns (EC50 ~0,2 μg/ml), a valin variáns (EC50 ~1,0 μg/ml) és a prolin variáns (EC50 ~1.5 μg/mL) fokozatosan magasabb doxiciklin-koncentrációt igényeltek a maximális expressziós kapacitás eléréséhez.
A G72 mutáció doxiciklin-érzékenységre gyakorolt hatásának ellensúlyozására további mutációkat vezettünk be a TetR-doménbe, amelyekről nemrégiben kimutatták, hogy növelik a doxiciklinnel szembeni érzékenységet10,11,27 . Kifejezetten a V9I, F67S, F86Y és R171K érzékenységnövelő (SE) mutációk bevezetésének hatását vizsgáltuk.
A 4A,B ábrán látható, hogy az SE mutációk javítják az SE-G72P és SE-G72A rtTA M2 variánsok doxiciklinérzékenységét. Amikor az rtTA-változatokat a teljesen aktivált β-ösztradiol indukálható promóterről nagy mennyiségben expresszáljuk (3a. ábra), az SE-mutációk bevezetése a G72P-változat esetében ~1,5 μg/ml-ről ~0,1 μg/ml-re csökkenti a doxiciklin EC50-et (4a. ábra), a G72A-változat esetében pedig ~0,2 μg/ml-ről ~0,02 μg/ml-re (4b. ábra). Ez a hatás a riporter-expresszió érzékelhető változása nélkül következett be teljes doxiciklin indukció mellett, és nem veszélyeztette az SE-G72P variáns dinamikai tartományát. Érdekes módon azonban az SE mutációk az SE-G72A variáns dinamikai tartományának jelentős csökkenését okozták azáltal, hogy doxiciklin hiányában növelték a riportergén expresszióját.
Az új rtTA-változatok doxiciklinérzékenysége az érzékenységet fokozó mutációk hozzáadásával javítható.
(a,b) 1000 nM β-ösztradiolban ubikvitálisan kifejezett rtTA-variánsok doxiciklin dózisfüggő aktiválása (három technikai ismétlés átlaga +/- s.e.m.). (c-f) Hőtérképek, amelyek a riporter-expressziót (tetszőleges egységek) mutatják a β-ösztradiol-függő transzaktivátor-expresszió és a doxiciklin-indukció függvényében.
Az rtTA expresszió szintje, a doxiciklin EC50 és az alapaktivitás közötti kapcsolat további feltárása érdekében megvizsgáltuk a β-ösztradiol és a doxiciklin indukció egyidejű változtatásának hatását a riportergének expressziójára. Négy különböző M2 variánst vizsgáltunk; az eredeti variánst, az SE mutációval rendelkező eredeti variánst, a G72P variánst és az SE-G72P variánst.
A kétdimenziós dózis-válasz felület az eredeti M2 variáns esetében három különböző riporter expressziós régiót tartalmaz, amelyek megfelelnek az alacsony, közepes és magas riporter gén expressziónak. Ezeket a régiókat a 4c-f. ábrán I, II és III jelöli. A III. régió az a terület, ahol a riportergén expressziója maximális, ami függ mind az rtTA expressziós szintjétől, mind a doxiciklin indukció szintjétől. A II. régió az, ahol a riporter expresszió viszonylag magas, még akkor is, ha a doxiciklin indukció alacsony. Az I. régió az, ahol a riporter expresszió alacsony a β-ösztradiol alacsony szintje vagy az alacsony doxiciklin indukció miatt.
Az SE mutációk önmagukban (4d. ábra) drámaian megnövelik a riporter expressziót az I. régió egy részében és a teljes II. régióban. Ez megerősíti, hogy ezek a mutációk az rtTA expressziós szintek egy szűk tartományában fokozhatják az érzékenységet, de az rtTA aktivitásának jelentős növekedését okozzák az indukálatlan állapotban is. Ezzel szemben a G72P mutáció önmagában (4e. ábra) drámaian csökkenti a riporter-expressziót a teljes II. régióban és a III. régió egy részében. Ez megerősíti, hogy e mutációnak az rtTA aktivitásra gyakorolt mélyreható hatása az indukálatlan állapotban a doxiciklin-érzékenység általános elvesztéséhez kapcsolódik.
A 4f. ábra az SE és a G72P mutáció kombinációjának hatását mutatja. Az SE-változathoz képest (4d. ábra) a G72P mutáció hozzáadása ellensúlyozza az SE-mutációk által okozott riporter-expresszió növekedését az I. régióban, és a riporter-expressziót kimutathatatlan szintre csökkenti ebben a régióban. Továbbá, a G72P variánshoz képest (4e. ábra), az SE mutációk hozzáadása szinte teljesen helyreállítja a riporter-expresszió csökkenését a III. régióban. Más szóval, az érzékenység javul anélkül, hogy szivárgó célgén-expressziót vezetnénk be bármely transzaktivátor-expressziós szinten.