A zöld anole gyík genomja és összehasonlító elemzése a madarakkal és emlősökkel

Az amnióta vonal ∼320 millió évvel ezelőtt osztódott az emlősök és hüllők ősi vonalára. Ma e vonal fennmaradt tagjai az emlősök, amelyek ∼4.500 fajt tartalmaznak, és a hüllők, amelyek ∼17.000 fajt tartalmaznak. A hüllőkön belül a két fő klád ∼280 millió évvel ezelőtt vált szét: a lepidoszauruszok, amelybe a gyíkok (köztük a kígyók) és a tuatara tartoznak; és az archoszauruszok, amelybe a krokodilok és a madarak tartoznak (a teknősök helyzete továbbra is tisztázatlan)6 . Az egyszerűség kedvéért a lepidoszauruszokat itt gyíkoknak nevezzük (1. ábra).

A teljesen szárazföldi életciklusra való átmenetet kísérő főbb genomikai események tanulmányozását számos emlős (K.L.-.T. et al., kézirat benyújtva) és három madárgenom2,3,4. Az A. carolinensis gyík genomja így fontos űrt tölt be az amnióták lefedettségében, kettéválasztva az emlősök és a madarak közötti hosszú ágat, és lehetővé téve az amnióta genomok robusztusabb evolúciós elemzését.

A hüllők szinte valamennyi genomja tartalmaz például mikrokromoszómákat, de ezeket szekvencia szinten eddig csak a madaraknál vizsgálták2,7, ami felveti a kérdést, hogy a madár mikrokromoszómák sajátos szekvenciajellemzői univerzálisak-e a hüllők mikrokromoszómáiban8. Egy másik példa a nemi kromoszómák evolúciójának tanulmányozása. Szinte minden placenta és erszényes emlősnek vannak homológ nemi kromoszómái (XY)9 , és minden madárnak vannak ZW nemi kromoszómái. A gyíkok azonban vagy genetikai, vagy hőmérsékletfüggő nemi meghatározottságot mutatnak10. A gyíkok nemi kromoszómáinak jellemzése lehetővé tenné a korábban ismeretlen nemi kromoszómák tanulmányozását és a közeli rokon fajok független nemi kromoszómarendszereinek összehasonlítását.

Az Anolis gyíkok egy sokszínű, ∼400 leírt fajból álló kládot alkotnak, amely az egész Neotrópiában elterjedt. Ezek a gyíkok gyakran konvergens módon sugároztak be különböző ökológiai fülkékbe, az ezzel járó morfológiai adaptációkkal együtt, az adaptív radiáció egyik legjobb példáját nyújtva. Különösen részletesen dokumentálták a különböző karibi szigeteken a fajok közötti verseny és a természetes szelekció révén többszörösen megismételt fülkékbe történő diverzifikációjukat11. Az A. carolinensis az egyetlen, az USA-ban őshonos anole, és Floridától és Texastól egészen Észak-Karolináig megtalálható. Azért választottuk ezt a fajt genomszekvenálásra, mert széles körben használják hüllőmodellként a kísérleti ökológia, viselkedés, fiziológia, endokrinológia, epizootika és egyre inkább a genomika területén.

A zöld anole genom szekvenálása és összeállítása (AnoCar 2.0) egy nőstény A. carolinensis gyíkból származó DNS felhasználásával történt (Kiegészítő táblázatok 1-4). A 405 bakteriális mesterséges kromoszóma (BAC) klón (hím egyedből származó) fluoreszcens in situ hibridizációja (FISH) lehetővé tette az összeállítási állványok kromoszómákhoz való rögzítését (5. kiegészítő táblázat és 1. kiegészítő ábra). Az A. carolinensis genomjának kariotípusa n = 18 kromoszómából áll, amely hat pár nagy makrokromoszómából és 12 pár kis mikrokromoszómából áll12. A genomszekvencia tervezete 1,78 Gb méretű (az összeállítási statisztikákat lásd a 3. kiegészítő táblázatban), és a madarak (0,9-1,3 Gb) és az emlősök (2,0-3,6 Gb) genomszekvenciái között helyezkedik el.

Megállapítottuk, hogy az anol és a csirke szétválása óta eltelt 280 millió év alatt kevés kromoszómaátrendeződés történt, amire a Xenopus és a csirke korábbi összehasonlításai utaltak13. A gyík és a csirke között 259 szintenikus blokk van (egymást követő szintenikus horgonyként definiálva, amelyek sorrendje, orientációja és távolsága konzisztens, 1 Mb-os felbontásban) (6. kiegészítő táblázat és 2. kiegészítő ábra). Érdekes módon a 22 lehorgonyzott csirke kromoszómából 19 mindegyike teljes hosszában egyetlen A. carolinensis kromoszómával szintenikus (2a. ábra); ezzel szemben az emberi kromoszómák közül csak 6 (a 23-ból) szintenikus egyetlen oposszum kromoszómával teljes hosszában, pedig a fajok csak 148 millió évvel ezelőtt váltak el egymástól14. A szegmentális duplikációk más amnióta genomokban megfigyelt trendeket követnek (Kiegészítő megjegyzés, 7. kiegészítő táblázat és 3. kiegészítő ábra).

Az A. carolinensis genomot mobil elemek alkotják, amelyek az aktív ismétlődő családok sokkal szélesebb választékát tartalmazzák, mint a madarak2 vagy az emlősök15 genomja esetében. A legaktívabb osztályok a hosszú interspersed (LINE) elemek (27%) és a rövid interspersed (SINE) elemek (16%)16 (8. kiegészítő táblázat). A LINE ismétlődések többsége öt csoportba tartozik (L1, L2, CR1, RTE és R4), és szekvencia-hasonlóságuk alapján úgy tűnik, hogy nemrégiben kerültek be (az eltérés 0,00-0,76% között mozog; hivatkozás 17). Ez ellentétben áll az emlősök genomjaira vonatkozó megfigyelésekkel, ahol csak egyetlen LINE-család – L1 – dominált több tízmillió év alatt. A DNS-transzpozonok legalább 68 családot foglalnak magukban, amelyek öt szupercsaládba tartoznak: hAT, Chapaev, Maverick, Tc/Mariner és Helitron18. A retrotranszpozonokhoz hasonlóan a DNS-transzpozoncsaládok többsége viszonylag fiatalnak tűnik, ellentétben a más amnióta genomokban található rendkívül kevés, nemrégiben aktív DNS-transzpozonnal (9. kiegészítő táblázat). Összességében az A. carolinensis mobil elemei szignifikánsan magasabb GC-tartalommal rendelkeznek (43,5%, P < 10-20), mint az egész genomra vonatkozó 40,3%-os átlag. A mobil elemeken kívül az A. carolinensis nagy sűrűségű (3,5%) tandem ismétlődéseket mutat, amelyek hossza és gyakorisági eloszlása hasonló az emberi mikroszatellita DNS-éhez15. Ma már tudjuk, hogy az amnióta genomok legalább három típusba sorolhatók: az emlősök genomjai L1 elemekben gazdagok és nagyfokú mobilelem-akkumulációval rendelkeznek, a madarak genomjai ismétlődésekben szegények, nagyon kevés mobilelem-aktivitással, míg a gyíkok genomja az aktív mobilelem-családok rendkívül széles diverzitását tartalmazza, de az akkumuláció mértéke alacsony, ami a teleosztahalak mobilelem-profiljára emlékeztet19.

A legtöbb hüllő genomja tartalmaz mikrokromoszómákat, de ezek száma fajonként eltérő; az A. carolinensis genomja 12 pár mikrokromoszómát tartalmaz12, míg a csirke genomja 28 párt. A madarak mikrokromoszómái nagyon jellegzetes tulajdonságokkal rendelkeznek a madarak makrokromoszómáihoz képest, például magasabb GC- és alacsonyabb ismétlődéstartalommal2 , míg a gyíkok mikrokromoszómái nem mutatják ezeket a tulajdonságokat (2b. ábra). Figyelemre méltó, hogy az A. carolinensis mikrokromoszómáihoz lehorgonyzott összes szekvencia a csirke genom mikrokromoszómáihoz is igazodik, és egy kivételével az összes A. carolinensis mikrokromoszóma csak egyetlen megfelelő csirke mikrokromoszómával szintenikus (2a. ábra). Az A. carolinensis és a csirke között konzervált mikrokromoszómák tehát a hüllő ősben keletkezhettek, míg a fennmaradó csirke mikrokromoszómák a madár vonalban származhatnak. Alternatív megoldásként a megmaradt csirke mikrokromoszómák jelen lehettek a hüllő ősben, de a gyík vonalban makrokromoszómákká fuzionáltak.

Az A. carolinensis genomban meglepően kevés a GC-tartalom regionális variációja, lényegesen kevesebb, mint amit korábban a madarak és emlősök esetében megfigyeltek; ez az egyetlen ismert magzatgenom, amelynek nukleotid-összetétele olyan homogén, mint a béka genomé5 (4. és 5. kiegészítő ábra). A 3. ábra szemlélteti, hogy a helyi GC-tartalom evolúciósan konzerválódott a 14. emberi kromoszóma és az 5. csirke kromoszóma között, de sokkal kisebb mértékben az A. carolinensis 1. kromoszómájával. Mivel az A. carolinensis kivételével minden szekvenált amnióta genom tartalmazza ezeket a homológ változó GC-tartalmú (“izokórákat”)20 , az ősi amnióta GC-heterogenitás valószínűleg a homogenitás felé erodálódott ebben a gyík vonalban. Azt javasolták, hogy a magas GC-tartalmú izokórák a magasabb rekombinációval jellemezhető régiókban a GC-biális génkonverzió magasabb arányának következményei2. Az anole genom nagyobb GC-homogenitása tehát egyenletesebb rekombinációs rátát tükrözhet, vagy pedig az A. carolinensis vonalban a génkonverziós események feloldása során a GC irányába való lényegesen kisebb torzítást (a vitát lásd a hivatkozott 5. hivatkozásban).

Az Iguania10-ben mind a hőmérsékletfüggő nemi meghatározottságot, mind az XY genetikai nemi meghatározottságot megtalálták. Az Anolis nemzetségen belül vannak heteromorf XY kromoszómákkal rendelkező fajok (beleértve a többszörös X és Y kromoszómákkal rendelkező fajokat), és vannak olyanok, amelyek teljesen homomorf kromoszómákkal rendelkeznek12. Az A. carolinensis esetében ismert a genetikai nemi meghatározottság21 , de a nyilvánvalóan heteromorf kromoszómák hiánya miatt a nemi kromoszómák formája (ZW vagy XY) mindeddig ismeretlen volt.

A hím és nőstény sejtek FISH segítségével történő alapos vizsgálata lehetővé tette, hogy a korábban “b”-ként jelölt mikrokromoszómát az A. carolinensis X-kromoszómájaként azonosítsuk; a nőstényekben két, a hímekben egy példányban van jelen. Ez a kromoszóma a csirke 15. mikrokromoszómájával szintenikus. Tizenegy BAC, amelyek két scaffoldhoz – 154 (3,3 Mb) és chrUn0090 (1,8 Mb) – vannak rendelve, FISH segítségével hibridizálnak a két X kromoszóma p karjához a nőstényeknél, és hibridizálnak az egyetlen X kromoszóma p karjához a hímeknél (4. ábra és 1. kiegészítő ábra). Az A. carolinensis így a genotípusos nemi meghatározás hím heterogámiás rendszerére jellemző mintázatot mutat. Az Y kromoszómát nem azonosítottuk, de feltételezzük, hogy az A. carolinensis X és Y kromoszómával is rendelkezik, mivel a hím és nőstény sejtek ugyanannyi kromoszómát tartalmaznak.

Az X-kromoszómához rendelt 5,1 Mb szekvencia 62 fehérjekódoló gént tartalmaz (10. kiegészítő táblázat); az e génekhez kapcsolódó Gene Ontology (GO) kifejezések nem mutatnak jelentős gazdagodást. Nagyon valószínű, hogy az AnoCar 2.0 összeállításban több olyan X-kromoszóma szekvencia van, amelyet jelenleg nem lehorgonyzott állványzatként jelölnek. Az A. carolinensis nemi meghatározó génjének azonosítása jelentős funkcionális biológiát igényel, de megjegyezzük, hogy a csirke DMRT1 nemi meghatározó génje az A. carolinensis 2. kromoszómáján található, és hogy a SOX3 (a therian emlősök SRY nemi meghatározó génjének X kromoszóma paralógja) egy nem lehorgonyzott A. carolinensis állványzaton található; ezek a gének tehát nem valószínű, hogy az A. carolinensis nemi meghatározó génjei.

Mind a tíz A. carolinensis nemi meghatározó gén. carolinensis egyedek (Dél-Karolinából és Tennessee-ből), amelyeket a FISH-térképezéshez használtak, nagy pericentromerikus inverziót mutattak az 1-4. kromoszómák egyikén vagy többjén, a különböző kromoszóma-inverziók vagy a gyík neme között nem volt összefüggés (lásd a Kiegészítő megjegyzést, a 11. kiegészítő táblázatot és a Kiegészítő ábrát.

Az A. carolinensis genom-összeállításból (Ensembl release 56, 2009. szeptember) összesen 17 472 fehérjekódoló gént és 2924 RNS-gént jósoltak meg.) Felállítottunk egy filogeniát az összes A. carolinensis gének és homológjaik nyolc másik gerinces fajban (ember, egér, kutya, oposszum, vízipók, csirke, zebrapinty és gömbhal), lehetővé téve egy konzervatív, 3 994 egy az egyben ortológ gént tartalmazó készlet azonosítását, azaz olyan génekét, amelyek az utolsó közös ősük óta egyik gerincesben sem duplikálódtak vagy törlődtek. Ezeket a génfilogeniákat arra is felhasználtuk, hogy azonosítsuk azokat a géneket, amelyek duplikációval keletkeztek a gyíkok vonalában a madarak vonalával való szétválás után, és külön azokat, amelyek az emlősök vonalában az emlős-hüllő szétválás után eltűntek (1. ábra, Kiegészítő megjegyzés, Kiegészítő ábra. 7. táblázat és 12. kiegészítő táblázat).

Az A. carolinensis 11 olyan opsin-gént találtunk, amelyeknek nincs emlős ortológjuk (de gerinctelenekben, halakban és békákban vannak ortológjaik), és így úgy tűnik, hogy az emlősök evolúciója során elveszett (13. kiegészítő táblázat). Az opsinok nagy repertoárja hozzájárulhat az anolák kiváló színlátásához – beleértve az ultraibolya tartományban való látás képességét -, és hozzájárulhat a hiperdiverzitásukhoz is, mivel lehetővé teszi a harmatlebeny változatos, fajspecifikus színezetének kialakulását, amely fontos szerepet játszik a szexuális szelekcióban és a fajfelismerésben11. Hasonlóképpen, az A. carolinensisben a szaglóreceptor és a β-keratin gének nagymértékben duplikálódtak (Kiegészítő megjegyzés és Kiegészítő 9. ábra).

Sok hüllő, köztük a zöld anolák is, abban különböznek a placenta emlősöktől, hogy ovipariák (tojást tojó állatok). A méhlepényes emlősöknél az ivipária egy származtatott állapot, ami abban nyilvánul meg, hogy elvesztettek néhány tojással kapcsolatos gént. Tömegspektrometriát használtunk az A. carolinensis éretlen tojásában jelen lévő fehérjék azonosítására, mivel a legtöbb tojásfehérje az anya szervezetében termelődik, majd az éretlen tojásba kerül. Azt találtuk, hogy az emlősökkel ellentétben a hüllőknél vonal-specifikus génduplikációk vannak, többek között a vitellogeninekben (VTG), az apovitellenin-1-ben, az ovomucin-α-ban és az ovocalyxin-36, a csirke tojáshéj-mátrix fehérjéjének három homológjában.

Eredményeink a tojásfehérjék génjeinek gyors evolúcióját mutatják az amnióták között. Konkrétan 276 A. carolinensis génből származó fehérjéket találtunk az éretlen A. carolinensis tojásokban (14. és 15. kiegészítő táblázat), amelyek közül tömegspektrometriával csak 50-nek a jelenlétét igazolták a csirketojásokban22,23 . Ezek közé a gének közé tartoznak a VTG-k, egy lizozim, a vitellinmembrán külső rétege fehérje 1 (VMO1) paralógjai, proteáz inhibitorok, natterin és nothepszin. Az A. carolinensisben és a csirkében egy az egyben ortológ gének összehangolásával azt találtuk, hogy a tojásfehérjék szignifikánsan gyorsabban fejlődnek, mint a nem tojásfehérjék (az átlagos dN/dS értékek (a nem szinonim helyettesítések arányának aránya a szinonim helyettesítések arányához képest) 0,186 és 0,135; P=1.2 × 10-5), ami a csökkent tisztító szelekciót és/vagy az adaptív evolúció gyakoribb epizódjait tükrözi.

A több gerinces genomszekvencia felhasználásával három VMO1 paralógot azonosítottunk (amelyeket α, β és γ néven neveztünk el), amelyek következtetésünk szerint jelen voltak az összes hüllő és emlős utolsó közös ősében. Míg a VMO1-α, VMO1-β és VMO1-γ genomok közül legalább az egyik elveszett az összes többi amnióta genomból, az A. carolinensis genom mindhárom paralóg képviselőit tartalmazza. Ráadásul az A. carolinensis-specifikus VMO1-α család 13 tagúra nőtt, és egy negatív töltésű, valószínűleg szubsztrátkötő üregben aminosavcserék pozitív szelekcióján ment keresztül; olyan változásokon, amelyek feltehetően módosítják a lizozimszerű transzferáz aktivitását (Kiegészítő megjegyzés, Kiegészítő 8. ábra és Kiegészítő 16. és 17. táblázat).

Az A. carolinensis kiterjedt és aktív ismétlődési repertoárja lehetővé tette számunkra, hogy felfedezzük számos emlős konzervált elem eredetét. Az exaptáció (egy szekvencia funkciójának jelentős megváltozása az evolúció során) folyamatán keresztül bizonyos mobil elemek, amelyek az amnióta ősben aktívak voltak, konzerválódtak és feltehetően funkcionálissá váltak az emlősökben, miközben az A. carolinensisben aktív mobil elemek maradtak. Ezeknek az emlősökben konzervált mobil elemekből álló szekvenciáknak az eredete nem volt felismerhető egy távoli és ismétlődésekben gazdag genomszekvenciával való összehasonlítás nélkül24. Az emberi genomban 96 ilyen exaptált elemet azonosítottunk (lásd a 18. kiegészítő táblázatot), amelyek az amnióta ősben jelenlévő mobil elemekre vezethetők vissza, amelyek még mindig jelen vannak az A. carolinensisben, különösen a CR1, L2 és cigány családok.

Bár a legtöbb exaptált elem nem kódoló és valószínűleg szabályozó funkciót tölt be, azonosítottunk egy fehérjét kódoló exont is, amely egy L2-szerű LINE-ból exaptálódott, és most a MIER1 (mesoderm induction early response 1) fehérje emlős-specifikus N-terminális régiójának 2. exonját alkotja. Ez az exon nagymértékben konzerválódott 29 emlősben, és ezért valószínűleg emlős innovációt képvisel az amniota ősök óta.

A humán genomban az egyes exaptált elemekhez legközelebbi transzkripciós starthelyhez kapcsolódóGO-terminusok idegrendszeri fejlődési génekkel való gazdagodást mutatnak (lásd Módszerek): az “ephrin receptor kötődés”, az “idegrendszeri fejlődés” és a “szinaptikus átvitel” erősen gazdagodott (valamennyi P-érték < 5 × 10-3). Ezek a gazdagodások összhangban vannak az idegrendszer fejlődésében az emlősök kialakulása során bekövetkezett adaptív változásokkal.

Az Anolis gyíkok az adaptív sugárzás tankönyvi esete, mivel a Nagy-Antillák minden egyes szigetén és az egész Neotrópiában egymástól függetlenül diverzifikálódtak, és ökológiailag és morfológiailag differenciált fajok széles skáláját hozták létre, egy helyen akár 15 fajt is találhatunk11. Bár az anolákat széles körben használják modellrendszerként filogenetikai összehasonlító vizsgálatokhoz, az ökológiai lehetőségek új dimenzióihoz való hozzáféréssel járó gyors evolúciós sugárzások miatt nehéz volt meghatározni a főbb anolakládok közötti evolúciós kapcsolatokat. Az ilyen sugárzással járó viszonylag rövid elágazási események sikeres feloldásához a megfelelő sebességgel fejlődő lókuszokból származó rengeteg adatra van szükség.

Az A. carolinensis genomszekvenciáját használtuk fel egy új filogenomikai adatkészlet kialakításához, amely 20 kb szekvenciaadatokból áll, amelyek 93 anolafaj genomjából származnak (19. és 20. kiegészítő táblázat). Ennek az adatsornak az elemzései egy jól alátámasztott filogeniára következtetnek, amely megerősíti és tisztázza az anolák adaptív és biogeográfiai történetét (5. ábra, részletek a 10. kiegészítő ábrán). Először is, filogenomikai elemzésünk megerősíti a korábbi molekuláris és morfológiai tanulmányokat, amelyek szerint a négy nagy Antillák-sziget mindegyikén egymástól függetlenül alakultak ki hasonló anola élőhelyspecialisták. Másodszor, elemzéseink összetett biogeográfiai forgatókönyvre utalnak, amely korlátozott számú, szigetek közötti terjedési eseményt és a szigeteken belüli kiterjedt in situ diverzifikációt foglal magában. Az Anolis legközelebbi rokonai a szárazföldön fordulnak elő, és a filogenetika megerősíti két kolonizáció létezését, az egyik a Kis-Antillák déli részén, a másik pedig a Karib-térség többi részén a különböző adaptív sugárzásokat eredményezte. Ez utóbbi kládon belül az anoliszok kezdetben elsősorban a két nagyobb Nagy-Antillák szigeten diverzifikálódtak (bár úgy tűnik, hogy Puerto Rico is érintett volt), mielőtt később másodlagos sugárzáson mentek keresztül az összes szigeten, és végül visszatértek a szárazföldre, ahol ez a visszagyarmatosítás kiterjedt evolúciós sugárzást eredményezett. A filogenetika azt is jelzi, hogy a Nagy-Antillák evolúciója során nagyon kevés szigetközi szétszóródási esemény történt. Inkább a Nagy-Antillák faunái, amelyek arról híresek, hogy minden egyes szigeten ugyanazok az ökomorfok fordulnak elő, elsősorban konvergens evolúció eredménye25.