B. B-sejt-epitópok
Az értekezésünket a fehérjék és peptidek B-sejt-epitópjaira korlátozzuk; más biopolimereken és haptenikus csoportokon lévő epitópokkal nem foglalkozunk. Az első fontos általánosítás a B-sejt epitópokkal kapcsolatban az, hogy a fehérjék és polipeptidek molekulafelületének háromdimenziós jellemzői ellen irányulnak. A különleges háromdimenziós topológia a B-sejt epitópok jellemzője, szemben a T-sejt epitópokkal. Valószínű, hogy bármely, a fehérje felszínéről elérhető aminosavmaradék része lehet egyik vagy másik B-sejt epitópnak (Benjamin és mtsai., 1984). Ezért a fehérjék nagyon sok különböző epitópot tartalmazhatnak, bár sterikus okokból egyszerre csak korlátozott számú antitest tud kötődni az antigénhez. A B-sejt válasz sztereospecifikus, sokkal gyengébb a peptidek (Gill et al., 1963) és fehérjék (Dintzis et al., 1993) d-enantiomerjeivel szemben, valószínűleg azért, mert a d-enantiomer fehérjéket nem dolgozzák fel hatékonyan, hogy a T-sejtek segítségére alkalmas peptideket kapjanak.
Régebben úgy gondolták, hogy a fehérjéknek jól meghatározott antigénszerkezete van, amelyet korlátozott számú epitóp jellemez. A B-sejtes immunválasz összetett természetének és szabályozásának, valamint a fehérjékkel szembeni monoklonális antitestek specifitásának megismerése világossá tette, hogy egy fehérje nem rendelkezik meghatározott antigénszerkezettel. Nem lehet meghatározni egy fehérje “teljes antigénszerkezetét”, ellentétben azzal, amit egyes kutatók állítottak (Atassi és Lee, 1978; Atassi, 1984). Egy fehérje antigenitása egyrészt a fehérje topográfiájának, másrészt a gazdaszervezet immunrendszerének szabályozó mechanizmusainak tulajdonsága, beleértve a gazdaszervezet saját fehérjéire hasonlító struktúrákkal szembeni toleranciát, a T-sejtes segítség specifitását és az idiotipikus hálózatokat (Benjamin és mtsai., 1984; Berzofsky, 1985). Az immundomináns helyek, vagyis azok a helyek, amelyekre az immunválasz legtöbb, de nem minden antitestje irányul, nem önmagukban a fehérje inherens tulajdonságai. Amint arra már korábban mások is rámutattak, az epitópok nem önmagukban léteznek, hanem csak a komplementer antitest-kötőhellyel, az úgynevezett paratoppal való kapcsolat révén (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Az epitóp tehát relációs fogalom, és az epitóp definíciója szükségszerűen operatív (Van Regenmortel, 1986). Más szóval, egy adott epitóp definíciója nagymértékben függ a megfelelő paratóp molekuláris geometriájától és kémiai természetétől, és ami talán még fontosabb, az epitóp feltérképezésére választott kísérleti megközelítéstől.
Ezt az állapotot jól szemlélteti az első olyan fehérje-antitest komplex példája, amelynek szerkezetét röntgenkrisztallográfiával oldották meg (Amit és mtsai., 1986). Ebben a komplexben a lizozim 16 maradványa érintkezik egy monoklonális Fab (antitestfragmentum) lizozim 17 maradványával. Az epitóp a lizozim felületének 750 Å2 -én húzódik. Ezzel szemben a szekvenciával rokon madár-lizozimekkel végzett epitóp-térképezés azt jelzi, hogy csak néhány maradék fontos a lizozim monoklonális antilizozim-antitestekhez való kötődésében. Nagyon kevés maradék mutációja radikálisan csökkentheti a lizozim-antitest komplex asszociációs állandóját (Harper és mtsai., 1987). Egy esetben egyetlen Arg-ról Lys-re történő szubsztitúció két nagyságrenddel csökkentette a lizozim monoklonális antitesthez való affinitását (Smith-Gill és mtsai., 1982). A lizozim két Fab fragmentummal alkotott komplexének kristályszerkezetén alapuló elméleti számítások kimutatták, hogy a kristályban az epitópot meghatározó számos maradék közül valójában csak néhány járul hozzá a komplex stabilitásához (Novotny és mtsai., 1989). Számításaik alapján Novotny és munkatársai megkülönböztettek egy energetikai epitópot és egy passzív epitópot. Az energetikai epitóp azokat a maradékokat foglalja magában, amelyek hozzájárulnak a kötés energetikájához. A passzív epitóp csak felületi komplementaritást biztosít az energetikai epitópot alkotó maradékok körül. Az influenzavírus neuraminidázának monoklonális antitesthez való kötődése megerősítette, hogy a kristályszerkezetben látható kölcsönhatások közül csak néhánynak van jelentős szerepe az antigén-antitest komplex stabilizálásában. A neuraminidáz tizenkilenc maradványa érintkezik a kristályban az antitest 17 maradványával, de csak 3 maradvány helyspecifikus mutációja szünteti meg teljesen a kötődést (Air és mtsai., 1990; Nuss és mtsai., 1993).
Az epitópok általánosan alkalmazható működési megkülönböztetése a kontakt epitóp és a funkcionális epitóp között. A kontakt epitóp az antigén-antitest komplex háromdimenziós szerkezetéből nyert információra vonatkozik; a funkcionális epitóp a nem kristályográfiás térképezési eljárásokból származó információra vonatkozik, beleértve a peptidekkel történő epitóp-térképezést is. A kontakt epitópot az antigén és az antitest nagy komplementer felületei közötti illeszkedés képviseli, amint az a fehérje-antitest komplexek számos röntgenszerkezetében látható (Davies és Padlan, 1990; Wilson és Stanfield, 1994; Braden és Poljak, 1995). A kontakt epitópok több száz négyzetangströmnyi molekulafelületet fednek le. A funkcionális epitóp olyan maradékokat határoz meg, amelyek jelentősnek tűnnek az antitestek kötődése szempontjából, és amelyek mutációja csökkentheti vagy teljesen megszüntetheti a kötődést. A funkcionális epitóp mindössze 2-3 maradékból állhat, mint a lizozim és a neuraminidáz fent említett példáiban. A funkcionális epitópból nem lehet levezetni a kontakt epitópot. Hasonlóképpen, a kontakt epitóp önmagában nem mutatja meg a funkcionális epitópot. Az antitestek részéről kétféle paratópot is megkülönböztethetünk: egy funkcionális paratópot és egy kontakt paratópot. Ez a monoklonális antitest komplementaritást meghatározó régióinak termodinamikai elemzéséből következik (Kelley és O’Connell, 1993).
Az epitóp kettős természete, ahogyan azt a kristallográfia és a nem kristallográfiai térképezési technikák feltárják, a molekuláris felismerés két különböző modelljét tükrözi. Így szemlélve az epitópok természetének meghatározásának nehézsége az episztemológiai nehézség szintjére tolódik: hogyan modellezzük a valóságot a rendelkezésünkre álló korlátozott kísérleti eszközökkel? Ezeket a korlátokat szem előtt kell tartanunk, amikor a peptidek általi epitóp-térképezést tárgyaljuk.
Itt kell megemlítenünk a B-sejt epitópok régóta ismert fogalmi osztályozását szekvenciális és konformációs epitópokra (Sela és mtsai., 1967; Sela, 1969; Atassi és Smith, 1978). Egy epitópot szekvenciálisnak vagy folyamatosnak nevezünk, ha egy polipeptidlánc összefüggő maradékainak sorozatával reprezentálható. Egy antitestről azt mondjuk, hogy szekvenciális epitópot ismer fel, ha egy rövid, rugalmas peptiddel vagy a denaturált, kibontott polipeptidlánccal reagál. A konformációs epitóp, más néven diszkontinuus vagy topográfiai vagy összeszerelt epitóp az aminosav-szekvencia nem összefüggő részeiből épül fel a polipeptidláncnak a natív fehérjében történő hajtogatásával. Egy antitestről azt mondjuk, hogy konformációs epitópot ismer fel, ha a natív fehérjével reagál, és nem a kibontott polipeptidlánccal, vagy ha egy egyedi konformációjú peptiddel, például egy hélixszel reagál, de egy véletlenszerű tekercs peptiddel nem.
A szekvenciális és konformációs epitópok közötti megkülönböztetés némileg önkényes és félrevezető lehet. Mivel minden paratópnak van egy jól meghatározott háromdimenziós szerkezete, a paratóp és az epitóp közötti kölcsönhatás mindig a struktúrák illeszkedése a háromdimenziós térben. Ez vonatkozik egy jól rendezett globuláris fehérjén lévő epitópra éppúgy, mint egy rövid, rugalmas peptiden lévő epitópra. Az utóbbi esetben a peptidnek is egyedi konformációt kell felvennie, amikor az antitesthez kötődik; ezért a folyamatos epitóp is “konformációs”. A kötődési konformáció vagy előre létezik, vagy a paratóp indukálja (lásd V,B és V,C szakaszok).
A natív fehérjékkel szembeni antitestek esetében azt állították, hogy a legtöbb vagy talán minden epitóp diszkontinuus (Barlow et al., 1986). Az antigén-antitest kristályban lévő tipikus kontakt epitóp nagy mérete miatt valóban valószínűtlen, hogy egy antitest kizárólag a polipeptidlánc egy összefüggő szakaszához kötődjön, és ne kötődjön a szekvenciában egymástól távol eső, de térben közeli kontakt maradékokhoz is. A fehérjék térkitöltő modelljei kevés, a molekula felületén elérhető, 4-5 maradéknál hosszabb, közvetlen peptidkötésben lévő lineáris szakaszokat mutatnak. Ez nem jelenti azt, hogy egy fehérje felszínén összeállított epitóp ellen irányuló antitest ne reagálhatna keresztreakcióban a fehérje egy szakaszának megfelelő peptiddel is.”
A B-sejt epitópok természetéről szóló áttekintésünket lezárva még egyszer hangsúlyozzuk, hogy az “epitóp” általános definíciójának megadása rendkívül nehéz. Az operatív definíciók pragmatikus alkalmazása talán nem tetszik a puristáknak, de az operatív definíciók hasznosak lehetnek egy adott antigén-antitest kölcsönhatás jellegére vonatkozó kérdések megválaszolásában.