Géntervezés, fúziós technológia és a TEV hasítási körülmények befolyásolják az oxidált diszulfidokban gazdag méregpeptidek tisztítását Escherichia coliban

A méregpeptideket kódoló gének kodonhasználata expressziós különbségeket okoz

Huszonnégy különböző hosszúságú, különböző fajokból származó méregpeptideket kódoló, különböző számú diszulfidhidat tartalmazó gént választottunk ki, hogy megvizsgáljuk a kodonhasználat hatását a tisztított fehérjék oldható szintjére. Ezek a gének evolúciósan, szerkezetileg és funkcionálisan változatos méregpeptideket kódolnak. A kísérlet célja annak értékelése, hogy a kodonhasználat finom változásai befolyásolhatják-e a rekombináns peptidek E. coliban történő expressziójának szintjét. Kezdetben minden gén három változatát úgy tervezték meg, hogy visszatranszlálták a méregpeptid-szekvenciákat egy Monte Carlo ismétlődő véletlen mintavételi algoritmus segítségével, amely a kodonok valószínűségi kiválasztására szolgál a kodonfrekvencia-kereső táblázatokból. A 72 kitalált gén (24 gén 3 változata) kodonhasználatát az 5. kiegészítő fájl: S5. táblázat mutatja be, és az Escherichia coli közepes vagy magas szinten kifejezett génjeinek kodonhasználatát tükrözi. A létrehozott génváltozatok azonban a DNS elsődleges szekvenciáiban olyan változásokat vettek fel, amelyek a kodonszelekció véletlenszerű mintavételezését és a géntervezéshez használt algoritmus által megengedett általános szabadságot tükrözik. Így a 24 adatkészlet három változatán belül az átlagos páros DNS-szekvencia azonosság 79,8% volt.

A 72 gént szintetizáltuk és a Gateway rendszer segítségével klónoztuk a pETG82A prokarióta expressziós vektorba T7 promóter kontrollja alatt és a citoplazmatikus expresszió érdekében a DsbC fúziós tag-et kódoló génnel fúzióban. E. coli BL21 (DE3) pLys S-t transzformáltuk a 72 plazmiddal, és önindukciós táptalajon tenyésztettük. A fúziós fehérjéket megtisztítottuk, a fehérjék integritását és hozamát Caliper Labchip GXII analízissel mértük (1a. ábra). Az érdeklődésre számot tartó peptidtől függően a tisztított frakciók a Caliper Labchip GXII-en főként egyetlen sávként (1., 2., 3., 4., … peptidek) vagy kettős sávként (5., 8., 16., 18., …) futnak. Az egyetlen sáv a jó fehérjepopulációt (His-DsbC-peptid) képviseli, míg az alsó sáv (29 kDa körül) a célpeptid csonkítása/lebontása után a His-DsbC fehérjének felel meg. Ez az alsó sáv valószínűleg azt jelzi, hogy a peptidpopuláció egy része nem volt megfelelően összehajtva, és lebomlott az expressziós vagy tisztítási folyamatok során. Az 1b. ábrán ábrázolt fehérjekoncentrációt csak a His-DsbC-peptid sáv integrálásával számoltuk ki a Caliper szoftver segítségével. Az 1b. ábrán bemutatott adatokból kiderült, hogy a tisztított fúziós fehérje hozama ∼1 mg/l (a 14. fúziós fehérje esetében) és 100 mg/l felett (a 4, 5, 8, 9, 10, 18 és 24. fúziós fehérje esetében) változott. A célfehérjék túlnyomó többsége (19/24) esetében a tisztított fúziós fehérje mennyisége lehetővé tenné milligramm nagyságrendű célpeptid tisztítását liternyi tenyészetenként (100% körüli hasítási és tisztítási hozamot feltételezve), míg a fennmaradó öt peptid (6, 7, 11, 13 és 14) esetében nagyobb mennyiségű tenyészetre lenne szükség.

A génváltozatok elsődleges szekvenciája és az expressziót befolyásoló tulajdonságok közötti összefüggést elemeztük. A káros motívumok, mint például az 5′ mRNS másodlagos struktúrák nem befolyásolhatták az expresszió szintjét, mivel a méreg gének mindegyike ugyanahhoz az 5′-prím szekvenciához volt fuzionálva, amely a fehérje fúziós taget kódolja. Nem volt összefüggés a fehérje expressziója és a diszulfidhidak száma, a peptid mérete, a CAI-érték és a GC-tartalom között (az adatok nem láthatóak). Ez arra utal, hogy a génexpresszióban mutatkozó különbségeket más, a szekvenciával kapcsolatos tulajdonságok, különösen a kodonhasználat határozta meg. Annak vizsgálatára, hogy a kodonhasználat változásai hogyan befolyásolják a rekombináns peptidek szintjét, a 24 adatsoron belül összehasonlítottuk az alacsony, közepes és magas expresszoros változatok fehérjehozamai közötti kapcsolatot. Az alacsonyabb szinten expresszálódó fúziós fehérjéket, amelyek a 6., 7., 11., 13. és 14. peptideket érintik (1. ábra), kizártuk az elemzésből. Az adatokból kiderült, hogy az elemzett peptidek magas, közepes és alacsonyabb expresszorú változatainak fehérjehozama szignifikánsan különbözött. Így az alacsonyabb expresszorok átlagosan 65,1 mg/l rekombináns fúziós fehérjét termeltek, míg a magasabb expresszorok fúziós fehérje-hozama átlagosan 87,55 mg/l volt (1b. ábra). Ezek a különbségek szignifikánsan különböznek (p = 0,01).

Az értékeléshez, hogy a kodonhasználatban mutatkozó különbségek milyen különbségek magyarázhatják a fehérjeexpresszióban megfigyelt különbségeket, összehasonlítottuk az alacsony és magas expresszáló változatok kodonhasználatát. A fúziós taget tartalmazó géneket is tartalmazó kodonhasználati táblázatok az S6. táblázatban találhatók. A kodonhasználatban mutatkozó jelentős különbségek különösen egy aminosavat, a ciszteint érintik, bár más maradékok, különösen az arginin, az aszparagin, a glutamát, a hisztidin, az izoleucin, a fenilalanin és a szerin esetében is megfigyelhetőek kisebb változások. A 8 aminosavra vonatkozó összefoglaló kodonhasználati adatokat az 1. táblázat tartalmazza. Az alacsony expressziós géneknél megfigyelt kodon-eltérés a Cys-TGC kodon preferenciáját mutatta, míg a magas expressziós géneknél a Cys-TGT-t részesítették előnyben. Ezenkívül az alacsony expressziós génekben a Cys-TGC 1,38-szor gyakrabban használatos, mint a Cys-TGT, míg a magas expressziós génekben a Cys-TGT csak 1,04-szer gyakrabban használatos, mint a Cys-TGC. Bár végül más tényezők is szerepet játszhatnak, ez a megfigyelés arra utal, hogy a peptideket kódoló gének magas expressziója a Cys-TGC és a Cys-TGT kodonok hasonló hozzájárulását igényli, ami arra utal, hogy az egyik kodon nagyobb aránya a másikhoz képest befolyásolja az expressziót. Az E. coli cisztein kodonhasználata szintén a két kodon kiegyensúlyozottabb felhasználására utal (1. táblázat). Annak érdekében, hogy megvizsgáljuk azokat a tényezőket, amelyek magyarázatot adhatnak erre a megfigyelésre, összehasonlítottuk az E. coli génekben és az e vizsgálathoz kiválasztott 24 méregpeptidben és a hozzájuk kapcsolódó fúziós fehérjékben található aminosavak gyakoriságát. A 2. ábrán bemutatott adatokból kiderült, hogy a cisztein ~12,5 és 3,5-szer gyakoribb a méregpeptidekben (14,3%), illetve a rekombináns fúziós fehérjékben (4,1%), mint az E. coliban (1,16%). Az adatok tehát arra utalnak, hogy a méregpeptidek magas szintű expressziójának kedvez a két cisztein kodon hasonló gyakoriságú jelenléte a szintetikus génekben. Ezáltal elkerülhető az egyik kodon kimerülése, amikor a gének nagyon magas szinten expresszálódnak.

A méregpeptidek expressziójának mértékét befolyásolja a fúziós tag

A pHTP1 gerincbe különböző fúziós tagek beillesztésével öt új vektort építettünk E. coli-ban történő rekombináns fehérjeexpresszióra. Valamennyi fúziós taget a rekombináns peptidek N-terminusára kell beilleszteni (3. ábra). A vektorok közül kettő olyan fúziós partnereket kódol, amelyek szignálpeptidet tartalmaznak, hogy a méregpeptidek expresszióját a periplazmába irányítsák (pHTP4, pHTP6). A többi fúziós tag citoplazmatikus rekombináns fehérje expresszióját eredményezi (3. ábra). Minden esetben 6HIS tag-et vezettünk be, hogy lehetővé tegyük a fúziós fehérjék downstream tisztítását immobilizált-nikkel affinitáskromatográfiával. A fúziós partner eltávolításának lehetővé tétele érdekében minden szintetikus génbe egy TEV (tobacco etch virus) proteáz hasítóhelyet (ENLYFQ/G) vezettünk be. Az 5 új vektor a 6HIS affinitási címke önmagán (pHTP1) kívül a DsbC diszulfid-izomerázt vagy a maltózkötő fehérjét (MBP) is tartalmazza. A DsbC inaktív mutáns származékát állítottuk elő, hogy megpróbáljuk megkülönböztetni a DsbC szerepét a passzív szolubilizációban (a fúziós fehérje hozamával kapcsolatban) és a redox-aktivitásban (a helyesen hajtogatott célpeptid hozamával kapcsolatban). Az ebben a vizsgálatban használt összes vektor sematikus ábrázolása a 3. ábrán látható.

Tizenhat jól jellemzett, különböző eredetű, különböző hajtásokat és ciszteinkötési mintázatokat képviselő méregpeptidet (köztük a fent leírt kodonhasználati kísérletben részt vett 7-et) választottunk ki ehhez a vizsgálathoz (lásd S3 táblázat). A 16 szintetikus gént hat különböző expressziós vektorba illesztettük be (lásd az S2. táblázatot és a 3. ábrát), összesen 96 rekombináns plazmidot létrehozva. A 96 konstrukciót BL21 (DE3) pLysS-ben transzformáltuk. A rekombináns E. coli törzseket önindukciós táptalajon tenyésztettük a nagy sejtsűrűség elérése érdekében. A nikkel-affinitásos tisztítást követően a Labchip GXII elektroszkópos diagramjainak szisztematikus elemzését végeztük el a tisztított fehérjék koncentrációjának meghatározására és a tisztított fúziós fehérjék látszólagos molekulatömegének a várt elméleti molekulatömeggel való összehasonlítására. A 4. ábrán bemutatott adatok azt mutatták, hogy a 16 peptid valóban előállítható fúziós címkével. A peptidtől és az alkalmazott fúziótól függően a tisztított fúziós fehérjék mennyisége a nullától (főleg akkor, amikor a peptideket pHTP1-be klónozták) több mint 300 mg tisztított fúziós fehérjéig terjedt literenként. Összességében úgy tűnt, hogy a kisebb peptideket könnyebb előállítani, mint a nagyobbakat, de több ellenpélda is van (mint például a T16, amely a vizsgálat legnagyobb peptidje). A 2., 4., 7., 8., 9., 14. és 15. peptidek esetében különböző vektorok tűntek megfelelőnek a fúziós fehérje kifejezésére, de a legtöbb esetben (16-ból 13 esetben) a pHTP4 (DsbC) vektor felülmúlta az összes többi vektort. Ezzel szemben a csak 6HIS taggel történő szolubilis expresszió kivétel nélkül mindig nagyon alacsony volt. A szignálpeptid jelenléte a DsbC esetében minden esetben (pHTP4 versus pHTP2) magasabb expressziós szintet eredményezett, átlagosan megduplázva az expresszált fúziós fehérje mennyiségét. Az MBP esetében (pHTP6 versus pHTP5) a jelenléte hasonló tendenciát mutat (10/16). A másik hat peptid esetében vagy hasonló volt a citoplazmatikus szint (1, 5, 11), vagy még szignifikánsan jobb (2, 7, 14). Összességében a 16 peptid közül, amikor a periplazmatikus DsbC nem volt a legjobb választás, akkor a citoplazmatikus (a 2. és 14. peptid esetében) vagy a periplazmatikus (4. peptid) MBP volt a legjobb választás. Végül a DsbC biológiai funkciójának inaktiválása nem volt hatással a méregpeptid fúziós fehérjék expressziós szintjére, mivel a pHTP2 és a pHTP3 expressziója általában nagyon hasonló volt.

A fúziós hasítást, a peptidhozamot és a helyes oxidációs állapotot elsősorban a fúziós partner és a TEV hasító pufferben lévő DTT koncentrációja befolyásolja

A fúziós címkékből a célpeptidek felszabadításához szükséges optimális TEV hasítási feltételeket számos paraméter befolyásolja, köztük az enzim/szubsztrát arány, a puffer összetétele, az inkubációs idő és a hőmérséklet. Annak vizsgálatára, hogy mely körülmények vezetnek a legjobb kihozatalhoz a hajtogatott méregpeptidekből, nyolc peptidet választottunk ki az előző kísérletben előállított 16 peptidből (lásd Additional file 3: S3. táblázat, peptidek dőlt betűvel, és 4. ábra, peptidek dobozokban). Mivel a DsbC fúziós partner a fúziós fehérje hozamát és általános alkalmazhatóságát tekintve felülmúlta a többi taget, ezeket a konstrukciókat választottuk ki a TEV hasítási optimalizálási vizsgálathoz. Az egyetlen paraméter, amely kritikusnak bizonyult, és ezért ebben a kísérletben finomhangolásra került, a hasítási pufferben lévő DTT-koncentráció (0, 0,1, 0,5 és 2 mM DTT) volt. Bár a TEV-proteáznak redukáló körülményekre van szüksége az optimális hasításhoz, a túlzott DTT-koncentráció a peptidek intra-diszulfid-hídjainak redukciójához, valamint a hajtogatás és a biológiai aktivitás elvesztéséhez vezethet.

A 18 órás inkubációs időszak után a TEV-fúziós peptidkeverék egy aliquotját savasítottuk. A hasítás hatékonyságának meghatározásához egy frakciót (“a” TEV hasítás előtt és “után”) betöltöttünk a kalibrátorba, és egy mintát elemeztünk az LC-MS-en a toxin mennyiségi meghatározásához és a megfelelő oxidációs állapot megerősítéséhez. A hasítási hatékonyságot, a tömegelemzést és a peptidhozamot az 5. ábra foglalja össze. A hasítás mind a 32 vizsgált körülmények között megtörtént (30 és 100% közötti hatékonysággal). A várakozásoknak megfelelően a hasítás nem volt teljes DTT hiányában, és a legmagasabb DTT-koncentrációval volt teljes. A nyolc peptid közül hétnél lehetett kimutatni az oxidációt mg mennyiségben a tenyészet literenkénti mennyiségében. A 32 mintából 19 adott megfelelő oxidált tömeget az LC-MS-en, a hasítás során a DTT koncentrációjától függően különböző hozamokkal. A fennmaradó 13 minta esetében az LC-MS-en nem volt kimutatható csúcs. A különböző DTT-koncentrációban helyesen detektált hét peptid közül négy 0,1 mM DTT-ben adta a legnagyobb visszanyerést, míg kettőnek nem volt szüksége DTT-re, egynek pedig 0,5 mM DTT-re az optimális visszanyeréshez (5. ábra, félkövérrel). A 0,1 mM DTT-koncentráció tűnt a legjobb kompromisszumnak, amelyet a következő kísérletekhez és a VENOMICS-projekt gyártási folyamatához meg kell tartani. A 7 peptidből származó aliquotokat 2 és 4 mg/ml-re koncentráltuk, és ugyanezen kísérletnek vetettük alá 0,1 mM DTT-vel, hogy megerősítsük, hogy a hasítás ilyen körülmények között is lehetséges. A hatékonyság átlagosan 20%-kal csökkent, de minden esetben bekövetkezett (az adatok nem láthatóak).

A hasítási feltételek optimalizálását követően a 96 tisztított fúziós fehérje (16 darab 6 vektorban, lásd az ábrát. 4) hasítását 0,1 mM DTT jelenlétében végeztük a tisztított poolok koncentrációjában (többnyire 0,2 és 2 mg/ml között) a fent leírt protokoll szerint. A hasítást és savasítást követően a 96 minta egy aliquotját LC-MS segítségével elemeztük a megfelelő molekulatömeg, a hozam és a végső rekombináns méregpeptid oxidációs állapotának megerősítése céljából. A kimutatás során a 96 rekombináns peptid molekulatömege megegyezett a teljesen oxidált ciszteinmaradványok esetén várt tömeggel (a tömegspektrometriás elemzés további részleteit lásd a kísérő cikkben); a fehérjék redukált formáit soha nem mutatták ki (az adatok nem láthatóak), valószínűleg a hasítási és savasítási lépések során a helytelenül oxidált peptidek kicsapódása miatt. A 6. ábrán bemutatott 96 konstrukció végső hozamát a peptidek abszolút végső hozamaként fejeztük ki mg/L kultúrában, vagy minden egyes peptid esetében 100%-ra normalizáltuk az expresszióhoz használt vektorhoz viszonyítva. Az adatokból (6. ábra) kiderült, hogy mind a 16 vizsgált peptid rekombinánsan előállítható, de eltérő mértékben. A fúziós változatok esetében kapott hozamhoz hasonlóan (4. ábra), egy általános tendencia arra utal, hogy a rövidebb peptideket könnyebb előállítani, mint a hosszabbakat. A végső méregpeptidhozam nagymértékben változott, a legrosszabb eset (0,3 mg/l, T10 a pHTP6-ban) és a legjobb eset (17,6 mg/l, T1 a pHTP4-ben) között 50-szeres különbség volt. Az adatkészletből az is kiderült, hogy a fúziós tag lehasítását követően jelentősen csökkent a hozam. Ez valószínűleg a hasítás utáni kemény visszanyerési feltételeknek köszönhető (savasítás 5%-os acetonitrilben, 0,1%-os hangyasavban), ahol a TEV-proteáz tetején minden hasított félrefordított peptid kicsapódik. Amint az a fúziós hozamok alapján várható volt, még magas visszanyerés esetén is a pHTP1-gyel előállított peptidek adták a legalacsonyabb peptidmennyiséget összességében (átlagosan 0,4 mg/l, a T8 esetében a maximum 1,9 mg/l volt). Ezzel szemben a pHTP4-gyel (DsbC) előállított peptidek 16 peptidből 11 esetében érték el a legjobb végső peptidhozamot, és ezek közül (a T11 kivételével) a hozamok minden peptid esetében meghaladták a 2 mg/L-t (átlagosan 4,6 mg/L). Összességében a DsbC fúziókkal (periplazmatikus vagy citoplazmatikus expresszió esetén) a 16 méregpeptidből 14-et sikerült előállítani. Továbbá egy peptidet (T7) csak a periplazmában lehetett előállítani a DsbC fúziós partnerrel, a pHTP4 vektorból. A más vektorokból (T10, 12, 13, 14, 16) preferáltan előállított peptidek esetében a hozamok nem haladják meg a 2 mg/l-t, ami kiemeli a pHTP4 vektorból történő robusztus expressziót. Ezen öt peptid esetében a legnagyobb hozamot három esetben citoplazmatikus expresszióval és DsbC fúziós partnerrel, majd két esetben periplazmatikus expresszióval és MBP fúziós partnerrel értük el. A legtöbb esetben (a T13,T14 és T16 kivételével) a periplazmába exportált fúzió (akár a DsbC, akár az MBP esetében) felülmúlta citoplazmatikus megfelelőjét, ami azt jelzi, hogy a hajtogatás legalább részben a periplazmában, részben pedig ex vivo, a tisztítás során történhetett. Szembetűnő bizonyítéka annak, hogy a DsbC (és valószínűleg az MBP) részben passzív szolubilizáló szerként működik a baktériumon belül, az a tény, hogy míg a DsbC és a mutált DsbC konstrukciók fúziós hozama a legtöbb peptid esetében nagyon hasonló volt (4. ábra), a hasítás és visszanyerés után az aktív peptid teljes hozama átlagosan háromszor nagyobb a redox-aktív DsbC fúzió esetében, mint mutált DsbC megfelelőjénél. A mennyiségi értékek részleteit a 7. kiegészítő fájlban foglaltuk össze: S7. táblázat.

A TEV hasítási hely C-terminális (P1′) maradékának jellege nem befolyásolja jelentősen a hasítás hatékonyságát

Az egyes méregpeptidek N-terminálisa hozzájárulhat a receptorkötőhelyükhöz. Így lehetséges, hogy egyetlen extra maradék bevezetése a peptid N-terminálisán befolyásolhatja annak biológiai aktivitását . A TEV proteáz kanonikus felismerőhelye egy Gly vagy Ser maradékot igényel a C-terminuson (P1′ pozíció), így a tag eltávolítása után egy nem natív Ser vagy Gly maradék marad a célpeptid N-terminusán. Egy korábbi tanulmány szerint a prolin kivételével az összes aminosav oldalláncot el lehet helyezni a TEV-proteáz felismerőhely P1′ pozíciójában, ami alig befolyásolja a feldolgozás hatékonyságát. Az elemzést azonban optimális TEV-pufferkörülmények között végeztük. Az időhatékonyság érdekében a méregpeptid-előállítási csővezeték nem képes további lépéseket, például puffercserét optimális TEV-körülmények közé helyezni. Ezért megvizsgáltuk, hogy a TEV-proteáz képes-e az IMAC elúciós pufferben (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, DTT 0,1 mM, pH8), amely nem optimális puffer a TEV-proteolízishez, működni. Az ebben a vizsgálatban használt TEVSH proteázt azért választottuk, mert E. coliban könnyen túltermelhető és tisztítható nagyon nagy mennyiségben (akár 100 mg/L kultúrában). A TEV-proteáz e rekombináns származékának hasítási specifitása azonban továbbra sem ismert, különösen akkor, ha a felismerőhely P1′ pozícióját különböző aminosavak foglalják el (Dr. H. Berglund, személyes közlés). Ezért e TEVSH-proteáz aktivitásának nem optimális körülmények között és a proteáz felismerőhely P1′ pozíciójának variálása esetén történő vizsgálatára 20 teszthasító fúziós fehérje szekvenciát állítottunk elő. Mindegyik fúziós fehérje tartalmazott egy N-terminális 6HIS tag-et, egy belső TEV felismerő szekvenciát, amelyek mindegyike más-más aminosavat tartalmazott a P1´ pozícióban, C-terminálisan a Homo sapiensből származó Kin17 DNS/RNS-kötő fehérje csonka formájához fuzionálva. A fehérjéket megtisztítottuk és TEV-proteáz hasításnak vetettük alá ugyanazokkal a feltételekkel, mint amelyeket a 96 fúziós címkék hasításához használtunk (lásd fent). A 7. ábrán bemutatott adatok megerősítik a korábban gyűjtött adatokat, és arra utalnak, hogy a prolin kivételével (a természetes eredetű méregpeptidek 1. pozíciójában a prolin előfordulásának valószínűsége alacsony) minden más maradék elfér a TEV-proteáz felismerőhelyének P1′ pozíciójában, miközben némi hasítóaktivitás megmarad. Figyelembe kell azonban venni az N-terminális Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val vagy Ile peptideket, amelyeknél a hasítási hatékonyság 60%-ra vagy az alá csökken. Ezekben az esetekben kompromisszumot kell kötni a hasítási hatékonyság/termelési hozam között, attól függően, hogy a peptid mennyire jól expresszálódik.

Megjegyezzük, hogy a méregpeptidekkel ellentétben a Kin17 nem tartalmaz ciszteinmaradványokat. Így a Kin17 esetében kapott sikeres hasítási hozamot, amikor egy ciszteinmaradék van az 1. pozícióban (86%), meg kell erősíteni azon peptidek esetében, amelyeknél az 1. pozícióban cisztein van, amely valószínűleg részt vesz egy diszulfidhídban a natív fehérjében.