A TOPO-klónozás egy olyan DNS-klónozási módszer, amely nem használ restrikciós enzimeket vagy ligázt, és nem igényel PCR utáni eljárásokat. Könnyen hangzik, igaz? A technika a komplementer bázispárok, az adenin (A) és a timin (T) alapvető képességére támaszkodik, hogy hibridizálódjanak és hidrogénkötéseket képezzenek. Ez a bejegyzés a “ragadós végű” TOPO (más néven TOPO-TA) klónozásra összpontosít; a TOPO klónozási technikát azonban tompa végű klónozásra is adaptálták.
Hogyan működik tehát a TOPO klónozás?
Amint az alábbi ábrán látható, a kék PCR-termék betétjén lévő “A” túlnyúlás a Taq-polimeráznak az amplifikációs lépéshez való használatából származik, mivel a Taq-polimeráz egyetlen dezoxiadenozin (A) marad a PCR-termékek 3′ végén. A párban lévő komplementer “T” a topoizomeráz I-linearizált gerincből származik. A DNS topoizomeráz I (zöld felhőként ábrázolva) restrikciós endonukleázként és ligázként is működik, a szupertekercselt DNS-végeket hasítja és újraegyesíti a replikáció megkönnyítése érdekében.
A TOPO technika kifejezetten a Vaccinia vírus által izolált topoizomeráz I-t használja, mivel ez az enzim felismeri az 5´-(C/T)CCTT-3′ DNS-szekvenciát, és a kettős szálú DNS-t ezen a szekvencián emészti. A törésből származó energia kovalens kötésként tárolódik a hasított 3′ DNS-szál és a topoizomeráz I egyik tirozil-maradványa között (1). Ha egy másik DNS-szálból származó 5′ hidroxilcsoport jelenik meg, az megtámadhatja ezt a kovalens kötést, így egyesítve a két DNS-szálat és felszabadítva a topoizomerázt (2).
A manapság kereskedelmi forgalomban kapható TOPO-készletek olyan vektorokat vagy klónozó karokat biztosítanak, amelyekben a topoizomerázhoz kovalensen kapcsolódó 3´ dezoxi-ti-midin (T) maradékok vannak. Az ezekben a készletekben található vektorok gyakran a topoizomeráz-helyet egy béta-galaktozidáz kazettába is beillesztik, ami lehetővé teszi a kutatók számára, hogy a transzformációt követően kék-fehér szűrést végezzenek – a vektorvégek önkötése kék kolóniákat eredményez, amelyeket nem kell kiválasztani és szekvenálni a potenciális pozitív klónok számára. Miután bevezettük a 3′-végű “A” túlnyúlásos inszertet, megtörténik a TOPO-klónozás varázslata.
Az alapeljárás
Mondjuk le a TOPO-klónozáshoz szükséges lépéseket:
1. Hozzuk létre a PCR-terméket: Tervezzen standard primereket (nem szükséges egyedi restrikciós helyeket hozzáadni a végekhez), és a kedvenc PCR-protokolljával amplifikálja a kívánt szekvenciát Taq-polimerázzal.
2. Állítsa be a TOPO klónozási reakciót: Keverje össze a PCR-terméket és a TOPO vektort.
3. Inkubáljon 5 percig szobahőmérsékleten: A reakciót jégre helyezheti, ha azonnal transzformálni kívánja, VAGY tárolhatja a reakciót -20C-on egy éjszakán át.
4. Transzformálja a TOPO klónozási reakciót kompetens sejtekbe: Ehhez használhatja a szokásos laboratóriumi protokollt; azonban az inkubációs időt jégen 5 percre kell csökkentenie (a teljes 30 perces inkubálás nem fogja jelentősen javítani a transzformáció hatékonyságát).
5. Válasszon ki és elemezzen 10 fehér vagy világoskék kolóniát: Az inzert jelenlétét PCR-rel, restrikciós emésztéssel vagy szekvenálással igazolhatja.
Pro tippek
- Ne adjon 5′ foszfátokat a PCR-primerekhez; szükség van a szabad hidroxilcsoportra!
- A PCR utolsó ciklusa után extra hosszabbítási időt érdemes beiktatni, hogy az “A” minden PCR-termékhez hozzáadódjon.
- Ne feledje, hogy a Taq-polimeráz hibaaránya körülbelül 1 a 3500 bázishoz. A Taq helyett általában korrektor funkcióval rendelkező polimerázokat használnak a hibaarány csökkentése érdekében; a korrektor polimerázok azonban az összes párosítatlan 3′ véget is eltávolítják a PCR-termékből. Ha csökkenteni kell a hibaarányt, kérjük, használja az alábbi módszerek egyikét annak biztosítására, hogy az inzert megőrizze a 3′ A túlnyúlást:
- Korrektor enzim és Taq keverékét használja, a Taq-ot 10:1 arányú feleslegben használva.
- Géltisztítsa meg a PCR-terméket, és inkubálja pufferrel, Taq-kal és dATP-vel 72C-on 10-15 percig.
- A PCR-termék és a TOPO vektor összekeverésekor érdemes extra sót adni a reakcióhoz:
A topoizomeráz I a PCR-termék és a vektor ligációjakor felszabadul a vektorból; azonban potenciálisan újrakötődhet és bevághatja az újonnan ligált DNS-eket. A só segít megakadályozni a topoizomeráz I újrakötődését, ami több ép molekulát eredményez. (Vegye figyelembe, hogy a hozzáadott só mennyisége attól függ, hogy a reakciót kémiailag vagy elektrokompetens E. coli-ban tervezi-e transzformálni – a túlzott sómennyiség az elektroporáció során íveket okoz, ami az elektroporáció sikertelenségéhez vezethet).
- A szobahőmérsékleten történő inkubálás során nem ajánlott túllépni az 5 perces időtartamot (hosszabb inkubálás esetén alacsonyabb transzformációs hatékonyságról számoltak be); azonban 20-30 percig is szükséges lehet inkubálni, ha a PCR-termék alacsony koncentrációjú, vagy ha rendkívül nagy méretű inszert klónoz.
- Mivel a standard ligációs reakció meglehetősen gyors, győződjön meg róla, hogy szervezett marad és előkészít mindent, amire a következő lépéshez szüksége van, mielőtt folytatja.
-
- A transzformáció beültetése előtt az antibiotikumot tartalmazó lemez előmelegítése lehetővé teheti, hogy 8 órán belül telepeket lásson.
1. Shuman S. “A vaccinia vírus DNS topoizomeráz I által közvetített rekombináció Escherichia coli-ban szekvenciaspecifikus”. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Új megközelítés a molekuláris klónozáshoz és polinukleotidszintézishez a vaccinia DNS topoizomeráz felhasználásával. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Kiegészítő források az Addgene blogon
- Plázmidok helyirányított mutagenezisének végrehajtása PCR segítségével
- A REPLACR Mutatgenezis használata a plazmidok inszercióinak és delécióinak egyszerű előállításához
- Tanulja meg, hogyan ellenőrizze a plazmidját
.