Macchio 3 éves korában kezdett sztepptáncórákat venni, és 16 éves korában fedezte fel egy tehetségkutató. Ezután kapta meg Jeremy Andretti szerepét az Eight Is Enough című televíziós sorozatban. Miután az Eight is Enough véget ért, elnyerte Johnny Cade szerepét az 1983-as The Outsiders című filmben. Ennek a szerepnek köszönhetően kapta meg Daniel LaRusso szerepét az 1984-es The Karate Kid című filmben és annak két folytatásában, a The Karate Kid Part II-ben és a The Karate Kid Part III-ban. Macchio szerepelt az 1986-os Crossroads című filmben, ahol Eugene Martone zenetanítványt alakította. Szintén 1986-ban Macchio szerepelt a Cuba and His Teddy Bear című filmben a Broadwayn, Robert DeNiro oldalán. 1992-ben Joe Pesci és Marisa Tomei oldalán szerepelt a My Cousin Vinny című sikervígjátékban, ahol Billy Gambinit alakította, akit tévesen vádoltak meg gyilkossággal, miközben egy alabamai kisvárosban járt. 1996-ban Macchio játszotta J. Pierrepont Finch főszerepét a How to Succeed in Business Without Really Trying című 1962-es Tony-díjas musical amerikai turnéjának felújításában, és pozitív kritikákat kapott. Az ugyanezen musical középiskolai előadásában kóristaként nyújtott alakítására utalva Macchio azt mondta: “Úgy ismertek, mint a ‘Táncoló kölyök’, nem mintha olyan nagyszerű lettem volna. De hároméves korom óta táncoltam, órákat vettem a June Claire School of Dance-ben Babylonban, Long Islanden.”
2005-ben Macchio önmagát alakította az HBO sorozatában, az Entourage-ben. 2007-ben szerepelt a No More Kings “Sweep the Leg” című dalának klipjében, mint saját maga és Daniel karikatúrája a Karate kölyökből. 2008-ban szerepelt egy VitaminWater reklámban, amelyben a NASCAR versenyző Carl Edwards szerepelt. Macchio-t Edwards “lelki tanácsadójaként” ábrázolták, és a Karate Kölyök ruháiba öltözött. 2008 októbere óta az ABC Network televíziós sorozatának, az Ugly Betty-nek több epizódjában is szerepelt, mint Archie Rodriguez, egy helyi politikus, és félig-meddig állandó szerepet kapott a sorozatban, mint Hilda szerelme. 2008 novemberében Macchio a 80. helyen szerepelt a VH1 100 legnagyobb tinisztárja között.
2010 júniusában Macchio szerepelt a Funny or Die online rövidfilmjében, a “Wax On, F*ck Off”-ban, amelyben szerettei közbelépést rendeznek, hogy az egykori gyereksztárból kiegyensúlyozott családapából bulvárbotrányoktól ostromlott függővé váljon, mindezt azért, hogy segítsék a karrierjét. A videó alatt Macchio arra reagál, hogy meglátta a 2010-es Karate Kid remake plakátját. A szkeccs visszatérő poénja, hogy Macchio összetéveszthető egy kamasszal. A rövidfilmet Bruce Fretts, a TV Guide munkatársa dicsérte, aki a videót “oldalbemászónak” és “komikus aranynak” nevezte. 2010. szeptember 20-án Macchio játszotta a felnőtt Carl Morellit Charles Messina A Room of My Own című darabjának színpadi felolvasásában, amelyet a Bleecker Street Theater Company mutatott be. 2011 februárjában bejelentették, hogy részt vesz az ABC Dancing with the Stars című műsorában. Az elődöntőben kiesett, az összesített versenyben a negyedik helyen végzett. Macchio szerepelt a kanadai Danko Jones együttes “Had Enough” és “I Think Bad Thoughts” című klipjében, amelyben Elijah Wood és Jena Malone is szerepel.
2012 áprilisában Macchio szerepet kapott a Hitchcock című filmben, amely Alfred Hitchcock and the Making of Psycho című non-fiction könyv alapján készült, Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel és Toni Collette főszereplésével, Sacha Gervasi rendezésében. Macchio a Psycho forgatókönyvíróját, Joseph Stefanót alakítja. 2013-ban szerepelt a How I Met Your Mother című sorozatban. A főszereplő, Barney Stinson azt állítja, hogy Macchio karaktere, Daniel LaRusso A karate kölyökben nem az igazi karate kölyök, hanem Johnny Lawrence, Daniel nemezise a filmben. A 8. évad “The Bro Mitzvah” című epizódjában Macchio meghívást kap Barney legénybúcsújára, bár Barney csalódott a meglepetésben, mivel William Zabka színészre, az “igazi Karate Kid”-re számított. Az epizód során a szereplők Barney és Macchio közötti hasonlóságot jegyzik meg, Barney undorára. Az este végén a parti szórakoztatására felbérelt bohócról kiderül, hogy ő Zabka. 2016 februárjától márciusáig Macchio Mario Cantone társszereplője volt az A Room of My Own című Off-Broadway produkcióban, miután 2010-ben és 2014-ben is olvasta a darabot.
Macchio jelenleg Daniel LaRusso szerepét játssza újra a Cobra Kai című, 2018-ban indult, epizodikus történetmesélő formátumban bemutatott Netflix akció-vígjáték-dráma sorozatban. A sorozat társproducere is, William Zabka mellett. A sorozat 34 évvel az 1984-es All Valley Karate Tournament eseményei után játszódik, és a lecsúszott Johnny Lawrence (Zabka) körül forog, aki – hogy rendbe hozza az életét, és jóvátételt kapjon az 1984-es versenyen elszenvedett vereségéért – újra megnyitja a Cobra Kai dojót. Ezzel újra fellángol a rivalizálása az immár sikeres LaRussóval, aki az időközben elhunyt mentora, Mr. Miyagi útmutatása nélkül küzd az egyensúly fenntartásáért az életében.