A genetikailag azonos élőlények nemi úton történő előállítását klónozásnak ismerjük ez egyetlen embrió osztódását jelenti, vagy a nukleáris gének és a kis számú mitokondriális gének lennének “azonosak”, vagy magátültetéssel járhat, ebben az esetben csak a nukleáris gének lennének “azonosak”. Sokéves küzdelem után 1995-ben a tudósok a skóciai “Roslin Institute”-ban klónoztak két bárányt, “Megan és Morag”-ot, akiket egy korai embrióból származó sejtekből klónoztak,1 bár kétéltűeket már az 1950-es években sikeresen klónoztak. Ezt követően jelentették, hogy számos bárány született klónozással. 1997 februárjában 277 kísérlet után klónoztak egy bárányt, amelyet “Dolly”-nak neveztek el.2 Dolly klónozása egy új korszak kezdetét jelentette a mezőgazdaságban a kiválasztott genotípusok védelmének és gyors szaporításának lehetőségével.3 Mostanáig számos állatot klónoztak nukleáris transzferrel olyan emlősöknél, mint a juh, kecske, szarvasmarha, nyúl, egér.4 A klónozásnak számos alkalmazása van, és megkönnyíti a kívánatos állatállományok gyors szaporítását, a transzgenikus haszonállatok szaporítását, a háziállatok célzott genetikai módosítását és a veszélyeztetett fajok megőrzését.1 Néhány kérdés azonban még mindig megoldatlan, mint például az etikai és erkölcsi kérdések, valamint a szomatikus sejtmagtranszfer alacsony sikerességi aránya a pontatlan nukleáris programozás következtében fellépő epigenetikai hibák miatt,5 mindezek a tényezők korlátozzák a klónozás kielégítő és mezőgazdasági alkalmazhatóságát.
A klónozás korlátozását számos ok összetett kölcsönhatása okozza, mint például az állatjólét és a klónozott állat hosszú távú egészségébe vetett bizalom hiánya.6 A klónozási technika alkalmazása során a legtöbb látszólag jó minőségű embrió nem fejlődik ki a vemhesség alatt vagy a születést követően.7 A sikertelenség fő oka az adományozott sejtmag átprogramozásának hibája, mivel az fontos a későbbi embriogenezis során a génexpresszió helyes mintázata szempontjából.8 Az átprogramozásnak rövid időn belül, a normál fejlődéshez képest eltérő sejtkörnyezetben kell megtörténnie, és hajlamos a hibára. Egyre több adat dokumentálja az epigenetikai átprogramozás eltéréseit.9
A klónozás sikertelenségi aránya nagyon magas,10 sok klónozott embrió fejlődhet preimplantációs stádiumba, de a túlnyomó többségből nem lesz életképes terhesség.11 Annak ellenére, hogy egészséges, termékeny, szinkron nőstényeket használtak recipiensként, arról számoltak be, hogy 50%-os veszteség következett be az első trimeszter korai szakaszában, és közel 80%-uk vetélt el a második trimeszterben, főként a placenta rendellenességei miatt.12 A teheneken és juhokon végzett vizsgálatok szerint a magzati veszteség legdrámaibb időszaka a placenta rögzülésének ideje.4 A vemhesség befejezése után a klónozott állatoknak nagyobb nehézségekkel kell szembenézniük a méhen kívüli élethez való alkalmazkodásban,13 normálisnak tűnnek, de genetikailag különböznek, és ez a különbség a nukleáris átprogramozás során szerzett epigenetikai rendellenességekre vezethető vissza10 . Számos terhességi és újszülöttkori rendellenességet találnak a klónozott állatokban,12 ami az imprintelt gének szabálytalan kifejeződésének és valószínűleg nem teljes átprogramozásának tudható be.14 Néhány más jelentés szerint a különbség a telomerek hosszának, a génexpressziónak vagy a metilációs mintázatoknak a rendellenességei miatt van.4
A másik probléma, amit a klónozott állatokban találunk, a méhlepény rendellenességei. Számos tudós szerint az embrió korai elhalása a méhlepény rossz fejlődésének köszönhető. Klónozott állatokban az allontoikus membrán rendellenes fejlődéséről és a placenta érrendszerének csökkent fejlődéséről számoltak be, a placentomák száma a klónozott állatokban jóval kevesebb15 , és úgy tűnik, hogy a placenta gázcsere-kapacitása jelentősen csökken, mivel a késői terhesség alatt a klónozott magzatok hipoxiásak voltak16.
A klónozott utódok születés utáni életképessége alacsonyabb a klónozott állatokban, de ez az állattól függ.17 A születés utáni időszakban a borjaknál többnyire légzési problémák18 , szív- és érrendszeri, csontrendszeri és központi idegrendszeri problémák jelentkeztek.7 Az epigenetikai hibák potenciális hatása a klónozott állatok összetételére, ezért az ebből származó élelmiszeripari termékek biztonságossága komoly akadályt jelentett az élelmiszerláncba való bekerülés hatósági jóváhagyásának megszerzésében.
Epigenetikai anomáliák
Az epigenetika a ”mitotikusan és/vagy meiotikusan öröklődő, a génműködésben bekövetkező olyan változások tanulmányozását jelenti, amelyek nem magyarázhatók a DNS-szekvencia változásaival.19 Az elmélet szerint a klónnak és a donorállatnak azonos genommal kellene rendelkeznie, de nem valószínű, hogy a klónozott emlősöknél időnként epigenetikai hibák miatt fejlődési anomáliák fordulnak elő.20 Néha a méhlepény és a magzat túlburjánzása, amelyet “nagy utód szindrómának “15 neveznek, más rendellenességek, például légzési zavarok, súlyos szív- és érrendszeri rendellenességek és a szervek megnagyobbodása gyakran előfordulnak a klónozott kérődzőkben21 , ezért a klónozás mezőgazdasági alkalmazhatósága nagyon korlátozott.22
A gyakorlati eredmény az, hogy sok klónozott állat viselkedik és tűnik normálisnak, miközben a közelebbi vizsgálatok kimutatták, hogy még e látszólag normális állatok közül is néhány finom eltérést mutat a természetes úton előállított populációtól.23 A klónozás során, amikor a szomatikus sejtet átviszik a donorból a recipiensbe, akkor a szomatikus sejtmagot gyorsan át kell programozni, hogy új életét embrionális sejtként élje.24 Mindenesetre, ha a sejt nem képes átprogramozni, vagy a teljes átprogramozás megszakadt fejlődéshez és esetleg nem halálos rendellenességekhez vezet a túlélő klónokban.4 Néhány gén megfelelően kifejeződik a klónozott embriókban, például fontos metabolikus enzimek, de néhány más gén kifejeződése többnyire abnormális, ami befolyásolja a klón jövőbeli életét. Ilyen körülmények között a legtöbb klón látszólag normális terhességet és újszülöttkori időszakot élt át, a normális életkilátások jónak tűnnek, de a méhlepény fejlődése és a méhen belüli környezet sok klón számára nem optimális, és ez önmagában hatással lehet későbbi életük egészségére.25
A DNS-metiláció fontos szerepet játszik az állatok fejlődését irányító génexpresszióban.5 Jelentések szerint az epigenetikai hibák elsősorban a DNS-metiláció mintázatában és a kromatin szerveződésében jelentkeznek a klónozott embrióban.19 Gyakran előfordul, hogy a donorsejtek DNS-metilációs mintázata megmarad a beültetés előtti fejlődés során14 , ami átprogramozáshoz vezet, és ez rendellenes placentációt okoz.26 Másodlagosan ez az alacsony születési arány egyik fontos oka.24
Placenta rendellenességek
A placenta az anya-magzat kapcsolat fő szerve, létfontosságú szerepet játszik a terhesség fenntartásában, és fenntartja a magzatot a pozitív tápanyagmegosztás és a kritikus endokrin funkciók kielégítésével. A magzat túlélése és fejlődése a terhesség alatt a méhlepény megfelelő morfológiai és funkcionális fejlődésétől függ. A klónozás mindig placenta rendellenességekkel jár, és a nukleáris transzferterhességekben a placenta meghibásodására utaló jelek közé tartoznak az olyan rendellenességek, mint a nagy utódok szindróma, a megváltozott placenta- és magzati membránfehérjék, a placenta megnövekedett súlya, valamint a placentó megnagyobbodása és ödémája szarvasmarháknál.27 A hydroallantois-t Farin a II. típusú abnormális utód szindróma állapotának minősítette.27 Ebben a kóros placentaállapotban a magzati fluid megnövekszik, és nehézséget okoz a magzat méhszarvban való elhelyezkedésében.27
A klónozott állatok korai vemhességében a magzati halálozás aránya közel 80%26 , ami többnyire a méhlepény hibás működésének és alulfejlettségének köszönhető.15 Jellemzően szarvasmarháknál az 50. napon a vemhességek 50-70%-a a vemhesség hátralévő részében és a terminusig elveszik a placenta érrendszerének és kötőhelyeinek hiánya miatt, amelyek fontosak a tápanyagcseréhez és a magzat hipoxiás állapotának megelőzéséhez.7 A klónozott magzatokkal vemhes tehenek harmadik trimeszterében néhány placenta rendellenességről, például ödémáról és hidroallantoisról is beszámoltak, amelyek előfordulási esélye közel 45%.28 A hidroallantois állapotát leggyakrabban a 150. és 180. nap között figyelték meg a klónozott vemhességekben.28 A kutatások szerint a placenta működési zavara és megnagyobbodása a placenta fehérjéinek köszönhető, amelyek a TIMP-229 túlzott expresszióját mutatták ki, de más kutatások szerint a klónozott placenták trofoblasztjának megváltozott génexpressziója is okozhatja ezt.30
Nehézségek a szülésben
A klónozás jelenleg általában alacsony efficienciájú, mivel számos tényező, például a sejtmag átprogramozása, a donor sejtek differenciálódása és a petesejt helyzete miatt.31 Az átprogramozás időszaka a klónozás optimalizálásának kulcsfontosságú szakasza.32 Ebben az időszakban, ha az átprogramozás nem megfelelően történik, akkor az epigenetikai rendellenességekhez vezet, és növeli a halálozási arányt. és a szomatikusan klónozott borjak láthatóan nehezebbek, mint az embrionális klónok33 , ami szintén példa az epigenetikai rendellenességekre, amelyek növelik a születési komplikációkat.13 A nagyméretű magzatot, beleértve az epigenetikai hiba miatti összes újszülöttkori rendellenességet, “nagy borjú szindrómának” nevezik.34 Gyakori, hogy a magzati transzferterhességekben a terhesség hossza eléggé elhúzódik, ami annak köszönhető, hogy a placenta nem képes a magzati kortizol felszabadítására a terminus közelében, vagy hogy a magzatból nem szabadul fel ACTH.26 A hormonális egyensúlyhiány és a magzat nagy mérete a dystocia felé vezető lépés, a kapcsolódó szülés utáni problémák mellett komoly negatív hatással lehet az anyaállat egészségére, valamint az állományban való jövőbeli termelésére és szaporodási teljesítményére is.7
A születés előtti és utáni életképesség
Az embrió akkor tekinthető jó minőségűnek, ha a sejtek száma elég jó, mert ez egy fontos kritérium, amely igazolja az embrió életképességét a béranyába történő átültetés után, így a klónozott embrió alacsony sejtszámához több fajnál is alacsony túlélési arány társul az embrióátültetést követően.35 Azok a klónozott szarvasmarha embriók, amelyekben magasabb volt az apoptotikus blasztomerek aránya, az embrióátültetést követő 90 nap után alacsonyabb vemhességi arányt és ezt követően alacsonyabb ellési arányt mutattak ki36.
A posztnatális életképesség sok klónozott esetében jelentősen alacsonyabb.37 A megszületett klónozott borjak közül a hosszabb távon túlélők aránya 47% és 80% között mozog.38 Születéskor a klónozott borjak és bárányok általában a stresszes méhkörnyezet jeleit mutatják; a placenta tartalékkapacitása valószínűleg korlátozott a nem megfelelő fejlődés miatt.7 Nyilvánvaló, hogy a klónozott állatok magzati életképessége kísérletenként és fajonként változik, a klónozott egerek és kecskék jobb születés utáni életképességet mutatnak, ami a technikának, az állattörzsnek vagy a méhlepény típusának tudható be.26 Néhány más esetről is beszámoltak a klónozott borjak fakó köldökzsinórjáról, amely a szülés utáni halál egyik lehetséges oka lehet.39 Klónozott borjaknál a megnagyobbodott köldökvénák és artériák szintén fontos halálozási okot jelentenek a szülés utáni időszakban a köldöki struktúrák szepszise miatt.39
Újabb kutatások szerint az érrendszeri problémák szintén a postnatalis halálozás okai, mint a pulmonális hipertónia, az elváltozások, az ödéma és a pleurális folyadékgyülemek, továbbá az alveoláris szepta kapilláris pangása és a hemodinamikai zavarokat okozó tüdőtrombózis. Ezek az elváltozások valószínűleg gátolták a teljes alveoláris tágulást, és magyarázatot adtak a tüdő elégtelenségre, amely hozzájárult a klónozott borjak születés utáni alacsony túlélési arányához.40 Ezek az érrendszeri fejlődési problémák a klónozás által okozott epigenetikai módosítások miatt elsődleges vagy kulcsfontosságú elváltozásokként jelentkeztek.
Noha ezek a bizonyos epigenetikai eltérések kisebb jelentőségűek lehetnek és nem jelentenek problémát az állat jóléte szempontjából, korlátozhatják a technológia néhány gyakorlati alkalmazását, mivel csökkentik a klónozott állatállomány lehetséges uniformitását.41 A klónozott fajok jól ismert diagonális fenotípusa a károsodott immunrendszerek megerősítése, a klónozott szarvasmarháknál a thymus aplasia, a klónozott egereknél pedig az alacsonyabb antitesttermelés.26 A károsodott immunrendszerek növelhetik a fertőzésekre és betegségekre való hajlamot.9
A klónozott bárányoktól a születés után vett vérminták a vese- és májműködési zavarokra utaló rendellenességek széles skáláját mutatták ki.32 A további veszteségek a születés utáni időszakban többnyire a szív- és érrendszer, a vázrendszer és a központi idegrendszer rendellenességei, köldök- és tüdőfertőzések, valamint emésztési és vese rendellenességek miatt következtek be.7 A születés utáni veszteségek a juhoknál nagyobbak, mint a szarvasmarháknál.26
A felnőtt klónok fenotípusai
Ha a gének kifejeződési mintázata a beültetés előtti és a korai beültetési szakaszban rendellenes, akkor a klón morfológiája is rendellenes lesz.42 A legtöbb esetben a klónok normálisnak tűnnek és normális élettannal rendelkeznek, mégis sok olyan jelentés van, amely a fenotípushoz kapcsolódó rendellenességeket mutat,41 mint például a “nagy utód szindróma”.9 Ez a magzati növekedés és fejlődés génexpressziós hibájának köszönhető.43 Ezeknek az anomáliáknak az előfordulása változhat a fajok, a genotípus, a nem, a sejttípus vagy a nukleáris transzfer protokoll speciális szempontjai szerint.4
Nagy hibaarány
A szomatikus sejtek nukleáris transzferét alkalmazó technikák gyakorlati alkalmazásának egyik akadálya a klónozott embriók alacsony esélye; a rekonstruált petesejteknek mindig csak néhány százaléka képes kifejlődni.43 Eddig a fajon belüli klónozás sikerességi aránya 1%44 , annak ellenére, hogy egészséges és szinkronizált recipiens használata mellett jó minőségű embriót használtak. A legtöbb emlősfaj esetében az embrió morfológiájának értékelése továbbra is az embrió kiválasztásának módszere, hogy a transzfer előtt kiválasszák a felhasználható embriók sokféleségét. Ez a legreálisabb és klinikailag leghasznosabb módja az embrió életképességének értékelésének14. A legtöbb esetben azonban még mindig jelentős terhességvesztésről számolnak be a korai fejlődési szakaszokban, körülbelül a terhesség 30-90 napos korában45 a méhlepényhártya meghibásodása és a méhlepényi erek fejlődésének csökkenése miatt,39 arról számoltak be, hogy a korai terhesség első trimeszterében a terhesség aránya kevesebb, mint a normális esetben elvárt érték fele, az embrióveszteség nagyon magas, és közel 80%-a vetél el a második trimeszterben, emellett a késői terhességben nagy az esélye a placenta és a végzetes rendellenességek kialakulásának, mint normális esetben.7 A harmadik trimeszteri veszteségek fő oka a hydroallantois és a magzati hydrops, amelyek általában a nem megfelelő placentációnak tulajdoníthatók.16 A szakirodalomban az is szerepel, hogy a klónozott magzatok elvesztése a hipoxiás állapotnak is köszönhető, mivel a klónozott állatokban kevesebb a placentó, ami kevesebb tápanyagot tud átadni az anyától a magzatnak, és kedvezőtlen körülményeket teremt a magzat fejlődéséhez15.
A klónozott borjak vemhességvesztésének és újszülöttkori halálozásának magas aránya a nem teljes nukleáris átprogramozásnak köszönhető; több szerző meggyőzően megerősítette, hogy a donor szomatikus sejtet úgy programozzák át, hogy a blasztociszta stádiumban az expressziós mintázat jelentősen eltér a szomatikus sejt nukleáris transzfer előtti expressziós mintázatától.46 Arnold és munkatársai szerint.,47 a normális méhlepényfejlődés szempontjából kritikus gének kifejeződése a klónozott szarvasmarha-embriókban rosszul alakul, és ez valószínűleg rendellenes trofoblaszt-differenciálódást okoz, és hozzájárul a terhesség elvesztéséhez. Még a folyamatban lévő utódok is nagy placentával és megnövekedett születési súllyal rendelkeznek, ami a nagy utódok szindróma14 néven ismert, és néhány látszólag egészségesnek tűnő utód immunrendszeri diszfunkcióban szenved, ami fokozott mortalitást eredményez.24
A Marfil és munkatársai egyik jelentése szerint48 a klónozott borjaknál a légzési distressz 19%, és ebben az állapotban a borjak a rendellenesség minden más jele nélkül elpusztultak. A megnagyobbodott köldökzsinór 37%, a hiper/hypotermia 17% és a depressziós/elhúzódó fekvés 20% a leggyakoribb halálozási okok a születést követő 24 óra és 60 nap között. Olyan problémák, amelyek csökkenthetik e borjak túlélését a születéskor vagy a születés körül, közé tartozik a megnövekedett vemhességi idő, a súlyos dystocia, a placenta elégtelen fejlődése és működése, valamint a méhen kívüli élethez szükséges metabolikus útvonalak hibái és néhány veleszületett probléma, mint a kisagyi hipoplázia, légzési zavarok és szívmegnagyobbodás.4
Normális lehet, hogy a klónok a konzervatív állatokhoz képest eltérő stresszérzékenységgel rendelkeznek, ennek következtében hajlamosabbak a kórokozókra, ami szintén növelheti a klónok halálozási arányát.23 A klónozás alacsony hatékonyságának legyőzésére különböző módszereket próbáltak ki, például különböző típusú donor sejtvonalakat, különböző tenyésztési rendszereket, különböző fúziós módszereket és vegyszereket használtak.35 E kutatási erőfeszítések némelyike a klónozott embriók minőségének kisebb mértékű javulásához vezetett, ami szorosan összefügg az embrió fejlődésével és az utódok termelékenységével.
Etika
Az állatok klónozása a fejlődés kulcsa a mezőgazdaság és az orvostudomány területén, de csak akkor elfogadható, ha a célok és módszerek etikailag indokoltak, és ha etikus feltételek mellett végzik. A tudósok kiterjedt kutatásokat végeznek az állatok klónozásával kapcsolatban, de most számos etikai kérdés merül fel. A klónozás figyelemre méltó eredménytelensége komoly veszélyt jelent az állatok jólétére.49 Gyakran a klónozási kísérletek kevesebb mint egy százaléka vezet sikeres születéshez, és azok közül, amelyek megszületnek, csak viszonylag kis százalékuk elég egészséges ahhoz, hogy néhány napnál vagy hétnél tovább éljen.35 Egy felmérés szerint az USA-ban az emberek 64%-a ellenzi a klónozást, úgy gondolják, hogy ez ellenkezik az állatok jólétével, ezért erkölcsileg helytelen.50
A klónozás során a legsúlyosabb etikai következmény az a fájdalom, amelyet az állatok elszenvednek a folyamat során, emellett a klónozás más állatpopulációkra is hatással van. Emiatt az embereket is súlyosan érintheti az állatok klónozása azáltal, hogy veszélyezteti az élelmiszertermelésben használt haszonállatok biztonságát51. A klónozás rossz hatással van mind a donorra, mind a recipiensre, mivel a klónozás során először a donorból eltávolítják a petesejtet, majd a recipiensnél ismét műtétet végeznek, hogy a petesejtet beültessék a legkevesebb eséllyel, hogy célt érjen, ráadásul ha az állat sikeresen befejezi a vemhességet, akkor valamilyen ismeretlen okból az utódok nagy súlya17 miatt többnyire császármetszésre van szükség, ami miatt az állatok ismét fájdalmat szenvednek.
Egyéb olyan problémáról is beszámoltak, amelyben az állatok fájdalmat szenvednek, és amely ellentétes az állatjóléttel, mint például a Hydroallantois, az a tipikusan végzetes állapot, amelyben a vemhes állat annyira megduzzad a folyadéktól, hogy úgy tűnik, mindjárt szétrobban48. Egyértelmű, hogy a nukleáris transzferrel előállított embriók bizonyos esetekben instabil magzati fejlődéshez, valamint a dystocia, a Sectio caesarea és a perinatális halálozás gyakoribb előfordulásához vezethetnek, ami negatív hatással lehet a befogadóra és az utódokra, és mindezek együttesen morális nehézségeket vetnek fel.52 A biológiai sokféleség egy biztonsági háló, amely védelmet nyújt a betegségek elterjedése ellen az állatokban, de a klónozás arra irányul, hogy a kívánt gének egy csoportját rögzítsük, és a kiindulási állat pontos másolatát hozzuk létre, ami ellentétes a sokféleséggel, és számos etikai kérdést vet fel.53
Élelmiszerbiztonság
Minden országban van külön osztály, amely foglalkozik a biotechnológiával előállított élelmiszerekkel. Az állati biotechnológiai termékeknek azonban át kell esniük a biztonsági értékelésen, amelyet a nyilvánosság és a kormányzat az emberi fogyasztásra való felhasználásuk elfogadása előtt végez el.23 A lehetséges epigenetikai hibák képesek megváltoztatni az élelmiszer összetételét, ezért a klónozott haszonállatokból származó élelmiszertermékek jelentős akadályt jelentenek a klónozott termékek élelmiszerláncba való bekerülésének hatósági jóváhagyásának megszerzésében. Emellett egy patkányokon végzett takarmányozási kísérlet megerősítette, hogy a klónozott állatokból származó hús felhasználása nem volt hatással a test növekedésére, a táplálékfelvételre, az általános állapotra, a mozgásszervi aktivitásra, a reflexekre, a szexuális ciklusra, a vizeletvizsgálatra, a hematológiára, a vér biokémiájára vagy a szövettanra.23 Mivel a technológia még mindig újnak és ismeretlennek számít, valamint a mai fogyasztó számára közvetlen előnyökkel járó termékek hiánya miatt nem meglepő, hogy a jelenlegi elfogadottság alacsony. A technológia érése és az ilyen termékek elérhetősége azonban a fejlett nyugati világ öregedő, hosszabb ideig egészségesnek maradni vágyó lakosságával együtt végül növelheti az elfogadottságot.54