Metodi
Il classico protocollo EMSA ha 4 fasi principali: 1) L’isolamento delle proteine dalle cellule. Poiché la stragrande maggioranza delle proteine attive che legano il DNA sono presenti all’interno del nucleo, viene utilizzato un protocollo di lisi sequenziale della membrana che produce proteine nucleari purificate. 2) Produzione e radiomarcatura della sonda DNA. Il fosforo 32 (32P) è attaccato alle estremità 5′ della sonda del DNA attraverso l’uso di 32P-γATP come substrato per la polinucleotide chinasi T4. Le sonde di DNA possono essere acquistate o realizzate su misura. 3) Le proteine purificate e le sonde a DNA radiomarcate sono co-incubate con un buffer di legame EMSA per promuovere il legame delle proteine con la sonda a DNA. Se si sta eseguendo un EMSA supershift, la reazione contiene anche un anticorpo selettivo che, legato ai complessi proteina-DNA, causa un ulteriore ritardo all’interno del gel. 4) I complessi DNA-proteina vengono caricati ed eseguiti su un gel di poliacrilammide non denaturante che provoca la separazione dei complessi DNA-proteina dalle sonde di DNA libere. I gel di poliacrilammide vengono poi asciugati e analizzati tramite autoradiografia.