Caratterizzazione dell’antinfiammatorio Lactobacillus reuteri BM36301 e dei suoi benefici probiotici su topi anziani

Caratterizzazione dei batteri lattici probiotici

Abbiamo isolato per anni i batteri lattici (LAB) da varie fonti tra cui esseri umani, animali, piante e prodotti alimentari. Queste collezioni di microrganismi Benebios (BM) sono composte da oltre 500 ceppi, con potenziali probiotici rivelati dai loro screening iniziali. In questo studio, abbiamo scelto quattro ceppi commensali umani derivati da campioni fecali e li abbiamo ulteriormente studiati in dettaglio (Tabella 1). Quelli specificamente esaminati erano due ceppi di Lactobacillus reuteri (BM36301 e BM36304), un ceppo di L. gasseri (BM33601), e un ceppo di Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Abbiamo esaminato i batteri rispetto alle loro qualifiche generali come probiotici (Tabella 1). In primo luogo, questi ceppi BM hanno mostrato resistenza contro gli acidi (pH 2,5) e i sali biliari (0,3%), dimostrando una gamma di tassi di sopravvivenza dal 43% al 98,5% dopo 1 ora di trattamento a 37 °C, che sono punteggi ragionevolmente alti. Successivamente, abbiamo testato le attività antimicrobiche contro i batteri enterici. Mentre L. gasseri BM33601 ha mostrato un’inibizione minima del ceppo tester E. coli, tutti gli altri hanno formato zone inibitorie distinte (0,5-3 mm di distanza dai bordi LAB). Questi effetti inibitori sono solitamente causati da batteriocine, acidi organici (acido lattico o acetico), perossido di idrogeno o etanolo del LAB. Infine, abbiamo esaminato la loro capacità di legarsi alle cellule epiteliali intestinali umane (IECs) in vitro. A questo scopo, abbiamo coltivato cellule di cancro del colon umano, HT-29, su vetrini coprioggetto per 15 giorni e applicato colture LAB vive su di esse per 1 ora (metodi). Dopo un ampio lavaggio, le cellule batteriche rimanenti sono state visualizzate mediante colorazione di Gram per il conteggio al microscopio. I ceppi L. reuteri BM36301 e BM36304 hanno mostrato alti punteggi di ritenzione (5,5-7,4 batteri per HT-29), mentre L. gasseri BM33601 aveva punteggi moderati (1,7 batteri per HT-29) e B. animalis subsp. lactis BM10307 aveva bassi (0,3 batteri per HT-29). Un’adesione più forte dei LAB agli IECs è particolarmente importante poiché essi devono rimanere nello strato della mucosa intestinale abbastanza a lungo perché i benefici abbiano effetto sull’ospite. Da questi esperimenti primari, i due ceppi di L. reuteri hanno rivelato un maggiore potenziale come probiotici di qualità.

Regolazione della produzione di TNF-α da parte dei batteri lattici in vitro

Abbiamo voluto selezionare i LAB per il loro potenziale di soppressione dell’infiammazione intestinale. A tal fine, abbiamo adattato un sistema di coltura di tessuti in vitro in cui le cellule mieloidi umane (THP-1) secernono TNF-α su attivazione dei loro recettori Toll-like (TLR) da lipopolisaccaridi batterici (LPS). In primo luogo, abbiamo verificato che le cellule THP-1 di 5 × 104 in 1 ml di coltura trattate con LPS al dosaggio di 150 ng/ml per 3,5 h di solito ha portato ad una produzione di 200-300 pg/ml TNF-α (Fig. 1a, corsie 1 e 2). Successivamente, abbiamo raccolto i surnatanti delle colture batteriche cresciute per 24 ore, li abbiamo asciugati sotto vuoto e abbiamo ricostituito il mezzo condizionato (CM) (metodi). Questo CM contiene attività complesse per sopprimere e indurre TNF-α, a seconda del LAB e delle condizioni di coltura. Infatti, abbiamo osservato una leggera produzione di TNF-α dai CM di BM36304 e BM36301 senza LPS, ma questa quantità era inferiore al 20% dell’induzione stimolata da LPS (dati non mostrati). Infine, abbiamo aggiunto ogni CM fino al 5% della cultura THP-1 (v/v) in presenza di LPS (Fig. 1a, corsie 3-6). La produzione di TNF-α con LPS (208 ± 49 pg/ml, corsia 2) è stata soppressa al 40% con la CM di L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, corsia 3), e al 52% con la CM di B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, corsia 6). Per i nostri scopi di screening, abbiamo considerato la soppressione di TNF-α vicina o inferiore al 50% dell’espressione dal trattamento con LPS come antinfiammatoria. Tuttavia, le CM di L. reuteri BM36304 e L. gasseri BM33601 non erano in grado di sopprimere la produzione di TNF-α fino a quel punto. Abbiamo verificato questa attività inerte preparando queste CM in varie condizioni di coltura (dati non mostrati).

In seguito, abbiamo esaminato la capacità di induzione di TNF-α delle cellule batteriche stesse perché i componenti cellulari dei batteri Gram positivi possono indurre risposte infiammatorie. A questo scopo, abbiamo fatto crescere i batteri fino alla fase esponenziale (16 ore), poi abbiamo raccolto, lavato e aggiunto queste cellule batteriche vive in eccesso (250 volte il numero di cellule) alla cultura THP-1. Le attività metaboliche delle cellule batteriche sono state tenute al minimo dagli antibiotici aggiunti nel mezzo THP-1. Dopo 6 ore di incubazione, il TNF-α secreto è stato misurato quantitativamente (Fig. 1b). Anche se tutte e quattro le cellule LAB sono state trovate per indurre TNF-α, BM36301 ha prodotto una quantità significativamente minore (609 pg/ml) rispetto alle altre: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml), e BM10307 (7141 pg/ml). Durante questa co-incubazione di 6 ore, abbiamo osservato che le cellule THP-1 hanno sperimentato una morte cellulare variabile a seconda del LAB utilizzato (file aggiuntivo 1). In particolare, BM36301, il più basso induttore di TNF-α, ha causato la minor quantità di morte di THP-1 (9,7%), mentre gli altri ceppi che inducono più TNF-α hanno causato una morte molto più importante (24-38%). Pertanto, non è il caso che BM36301 abbia indotto un basso livello di TNF-α a causa della perdita di vitalità dei THP-1 di per sé. Per i nostri scopi di screening, abbiamo considerato LAB con una produzione attiva di TNF-α superiore a 1000 pg/ml come pro-infiammatoria.

In sintesi, le attività di immunomodulazione in vitro sono state assegnate come anti-infiammatorie con le CM soppressive (BM36301 e BM10307) e pro-infiammatorie con le cellule vive induttive (BM36304, BM33601, e BM10307). Poiché BM10307 ha mostrato entrambe le attività, lo abbiamo assegnato come possessore di una doppia funzionalità (Fig. 1c). È stato interessante notare che i due ceppi di L. reuteri hanno mostrato attività distinte. Dallo screening iniziale della nostra vasta gamma di collezioni di BM, i ceppi anti-infiammatori si sono dimostrati piuttosto rari, con un tasso di scoperta inferiore al 5% (dati non mostrati). Anche alcuni ceppi non hanno mostrato alcuna attività, rientrando così nella categoria dei “neutri” (dati non mostrati).

Le molecole soppressive nelle CM sono stabili al calore e alla tripsina

Siccome le CM dei LAB sono composte da vari metaboliti batterici e componenti cellulari, abbiamo cercato di capire meglio la natura antinfiammatoria delle CM. L’espressione di TNF-α è diminuita quantitativamente con l’aumento delle concentrazioni dei CM di L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) e B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). È interessante notare che una minore quantità di CM da BM36301 (0,5× ingresso o 2,5 % v/v) ha effettivamente indotto TNF-α ulteriormente, coerente con l’osservazione che questo CM contiene materiali TNF-α-induttori in una certa misura (Fig. 2a, corsie 2 e 3). Tuttavia, gli effetti soppressivi sono diventati dominanti di fronte a quantità maggiori di CM, suggerendo che i materiali antinfiammatori sono quantitativamente additivi e che i recettori corrispondenti sulla superficie delle cellule THP-1 sono abbastanza abbondanti da rispondere prontamente all’aumento del trattamento con CM. Nel complesso, queste osservazioni suggeriscono che le CM contengono metaboliti attivi responsabili della soppressione del TNF-α, nonostante la loro natura complessa.

Abbiamo ulteriormente esaminato le caratteristiche fisico-chimiche dei materiali anti-infiammatori nelle CMs. Bollire le CM di ogni ceppo per 10 minuti è risultato inefficace nell’alterare le loro funzioni inibitorie del TNF-α rispetto alle CM native (Fig. 2c, corsie 3 e 4). Allo stesso modo, il trattamento con tripsina non ha influenzato le loro attività (Fig. 2c, corsia 5). Queste osservazioni suggeriscono che i principali fattori inibitori in queste CM non sono né proteine né molecole sensibili al calore.

Regolazione del TNF-α nei topi con batteri probiotici

La domanda finale per quanto riguarda la regolazione del TNF-α in vitro basata sul nostro screening LAB era quanto sarebbe stato rilevante con le applicazioni in vivo. Abbiamo cercato di rispondere direttamente a questa domanda applicando i ceppi di L. reuteri selezionati a un sistema di modello murino. Abbiamo preparato topi inbred C57BL/6 di 20 settimane, 6 maschi e 8 femmine per gruppo. Poi per un periodo di 20 settimane, un gruppo è stato trattato con l’anti-infiammatorio BM36301, un altro gruppo è stato trattato con il pro-infiammatorio BM36304, e il gruppo di controllo è stato trattato con destrosio (metodi). Come mezzo per minimizzare l’angoscia sugli animali, le colture LAB sono state somministrate tramite acqua potabile per soddisfare il dosaggio di consumo giornaliero di 1 × 106 batteri per topo. Abbiamo anche fornito una dieta standard in modo che il processo di invecchiamento fosse naturale durante il periodo. Alla fine dell’incubazione di 20 settimane (totale 40 settimane di età), abbiamo eutanasia i topi e prelevato il sangue per la preparazione del siero per misurare citochine e testosterone utilizzando metodi ELISA quantitativi. Al momento della necroscopia, non abbiamo trovato alcuna anomalia morfologica evidente.

In sintesi, abbiamo osservato una riduzione del siero TNF-α con l’anti-infiammatorio BM36301, con un effetto più pronunciato osservato nelle femmine. Il pro-infiammatorio BM36304 ha portato ad un aumento di TNF-α nei maschi, ma non nelle femmine. Questi risultati suggeriscono che il nostro screening in vitro ha una rilevanza significativa con il mantenimento in vivo del TNF-α in queste prove sui topi.

L. reuteri BM36301 ha mantenuto un ridotto aumento di peso corporeo e un elevato testosterone nei topi maschi

L’invecchiamento è la fonte di molti problemi di salute negli esseri umani, tra cui il diabete e l’obesità. Al fine di esacerbare tali problemi di invecchiamento nel modello animale, vengono spesso impiegate diete ad alto contenuto di grassi. Tuttavia, l’interpretazione di questi esperimenti accelerati può essere complicata poiché nessun invecchiamento negli esseri umani dovrebbe essere guidato da una dieta ad alto contenuto di grassi. Abbiamo coltivato tutti i topi con una dieta standard in modo che il loro processo di invecchiamento potesse essere più naturale. Nelle 20 settimane di esperimento a partire dall’età di 20 settimane, i maschi del gruppo di controllo hanno guadagnato circa 8 g di peso (7,83 ± 1,2 g) e le femmine del gruppo di controllo hanno guadagnato circa 5 g di peso (4,8 ± 0,94 g). Notevolmente, è stato notato che l’aumento di peso nei maschi alimentati con l’anti-infiammatorio BM36301 era significativamente inferiore rispetto al controllo (5.78 ± 0.75 g, p = 0.040) del 36% (Fig. 4a, corsie 1 e 2). Tuttavia, l’aumento di peso dei maschi trattati con BM36304 (7,53 ± 0,74 g) non era significativamente diverso dal controllo (p = 0,67). Gli aumenti di peso dei gruppi femminili non erano statisticamente diversi tra loro.

Un’altra differenza significativa era il livello di insulina nel siero dai maschi trattati con BM36304 (Fig. 4b). Mentre il gruppo maschile di controllo ha mostrato 3.18 ± 0.65 ng/ml di insulina, il gruppo maschile alimentato con BM36304 ha mostrato 4.91 ± 0.63 ng/ml di insulina (p = 0.027). Tuttavia, coerente con la constatazione che l’aumento di peso di questo gruppo non era molto diverso dal controllo (Fig. 4a), non abbiamo osservato un accumulo di grasso addominale più prominente nei maschi trattati con BM36304 (dati non mostrati). A 40 settimane, il picco di insulina potrebbe non aver causato il diabete clinicamente evidente nei topi, ma la malattia potrebbe essere diventata più pronunciata se i topi sono invecchiati ulteriormente. La variazione di insulina tra i gruppi femminili non era significativamente diversa l’una dall’altra.

Infine, ci siamo concentrati sui livelli di testosterone dei maschi. Come mostrato in Fig. 4c, i maschi alimentati con BM36301 anti-infiammatori hanno mantenuto livelli significativamente più alti di testosterone nel siero (5.18 ± 0.87 ng/ml) rispetto al gruppo di controllo (2.20 ± 0.38 ng/ml, p = 0.0025). Tuttavia, il gruppo trattato con BM36304 non era statisticamente diverso (3.23 ± 2.10 ng/ml, p = 0.07) dal controllo. Al fine di comprendere ulteriormente i risultati del testosterone, abbiamo esaminato i testicoli di ogni topo. Il peso dei testicoli appaiati dei maschi alimentati con BM36301 era di 0,579 ± 0,075 g, 10 % più pesante di quello del controllo (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Considerando il minore aumento di peso nel gruppo BM36301 (Fig. 4a), questa differenza di dimensioni dei testicoli è più evidente; il rapporto tra il peso dei testicoli e il peso corporeo (TW/WG) del controllo era solo il 67% di quello del gruppo BM36301. Tuttavia, non abbiamo potuto osservare differenze microscopiche dei tessuti dei testicoli, come il diametro dei tubuli seminiferi tra questi due gruppi (156,03 ± 6,65 μm del controllo contro 153,95 ± 18,66 μm dei maschi trattati con BM36301, p = 0,51). Non abbiamo eseguito altri studi come il confronto della spermatogenesi o dell’area delle cellule di Leydig.

In sintesi, l’anti-infiammatorio BM36301 ha aiutato i maschi a mantenere un aumento di peso inferiore con testicoli più grandi e più testosterone con l’invecchiamento. La riduzione della produzione di testosterone nei maschi invecchiati è stata proposta per essere collegata con lesioni dipendenti dall’età nei testicoli, presumibilmente come risultato di un insulto infiammatorio. Nel frattempo, il pro-infiammatorio BM36304 ha innescato un aumento di insulina, anche se senza cambiamenti nell’aumento di peso o testosterone tra i maschi. In particolare, nessuno di questi ceppi batterici ha avuto influenze significative su queste misure corporee nei topi femmina.

Pelle femminile sana dall’antinfiammatorio BM36301

Una caratteristica interessante di alcuni probiotici è che possono promuovere la salute della pelle in un modo dipendente dalla regolazione immunitaria. Poiché il BM36301 ha mostrato anche effetti antinfiammatori in vitro e in vivo, ci siamo chiesti se questo ceppo può provocare tali benefici per la salute della pelle. Alla 18a settimana di trattamento, abbiamo rasato una zona su 2 topi di ogni gruppo e li abbiamo esaminati dopo 1 settimana. È interessante notare che i topi femmina alimentati con BM36301 hanno mostrato una ricrescita dei capelli più veloce, anche se non un recupero completo, nella zona rasata (Fig. 5a). Al contrario, i gruppi di controllo o BM36304 non hanno mostrato un ritmo così rapido di recupero. Nessuno dei maschi trattati ha mostrato una ricrescita dei capelli distintamente più veloce del controllo, indicando che questa crescita accelerata dei capelli può essere evidente solo nelle femmine. Un’altra metrica per valutare la salute della pelle è l’esame della lucentezza del pelo. Tuttavia, non abbiamo osservato differenze significative tra ciascun gruppo attraverso misurazioni sensoriali o con l’esposimetro, principalmente a causa delle condizioni relativamente lucide del pelo dei controlli (dati non mostrati).

Abbiamo ulteriormente valutato la salute della pelle esaminando la pelle sezioni trasversali al microscopio dopo colorazione con ematossilina ed eosina. Come mostrato in Fig. 5b e c, abbiamo trovato che i topi femmina trattati con BM36301 hanno mostrato un maggior numero di follicoli piliferi sottocutanei (HF) rispetto ai topi femmina di controllo. I conteggi HF per vista microscopica a 400 × risoluzione erano 3.50 ± 0.52 per il gruppo di controllo femminile, mentre i conteggi erano 4.80 ± 0.61 da BM36301 alimentato femmine con una differenza significativa (p = 0.023). Tuttavia, le femmine trattate con BM36304 hanno presentato solo un leggero cambiamento (4,15 ± 1,73, p = 0,55 rispetto al controllo). Su un’analisi più dettagliata dei follicoli piliferi, abbiamo trovato che le femmine BM36301-alimentate hanno visualizzato marginalmente più fasi del ciclo dei capelli attivi rispetto al controllo (anagen + catagen: telogen era 81: 19 dal controllo vs 95: 5 da BM36301-alimentati femmine). Nel frattempo, i conteggi HF dei gruppi maschili non erano molto diversi tra loro (Fig. 5b). Infine, abbiamo anche valutato lo spessore della pelle misurata come la profondità dall’epidermide al pannicolo carnoso (Fig. 5c, file aggiuntivo 1). Non abbiamo potuto trovare molta differenza di profondità tra il controllo e le femmine trattate con BM36301. Tuttavia, gli strati dermici dei topi alimentati con BM36301 hanno dimostrato marginalmente più profondo rispetto ai controlli, e il tessuto adiposo dai topi trattati con BM36301 era meno profondo di quello del controllo. La maggior parte degli HF sottocutanei sono stati trovati nel derma.

Nell’insieme, queste osservazioni suggeriscono che il trattamento con BM36301 anti-infiammatorio ha favorito una pelle più sana, come evidenziato dalla ricrescita dei capelli e dal numero di HF nelle femmine. Tuttavia, le differenze microscopiche dei campioni di pelle tra il controllo e i gruppi BM36301 sono apparse piuttosto marginali. Questi benefici per la salute della pelle non sono stati osservati nei maschi. Inoltre, il pro-infiammatorio BM36304 non ha causato alcun effetto negativo sulla pelle al momento degli esperimenti.