Confronto tra analisi cromosomica e analisi microarray cromosomica: qual è il valore dell’analisi cromosomica nell’era dell’array genomico di oggi?

L’analisi cromosomica e la CMA sono strumenti diagnostici clinicamente utili per rilevare anomalie cromosomiche in tutto il genoma umano. Attualmente, la CMA è raccomandata come test di primo livello per la disabilità intellettuale e i difetti congeniti, sostituendo il precedente ruolo dell’analisi cromosomica. In questo studio, abbiamo confrontato i risultati dell’analisi cromosomica e della CMA in 3.710 casi per determinare il valore dell’esecuzione dell’analisi cromosomica.

Massima individuazione del mosaicismo mediante una combinazione di CMA e analisi citogenetica tradizionale

Questo studio ha mostrato che l’1,2% (43/3.710) dei pazienti aveva un reperto a mosaico. Il mosaicismo è stato osservato solo dall’analisi cromosomica nel 39% dei casi a causa di una percentuale molto bassa (<10%) o molto alta (>80%) di cellule anormali mentre il 12% dei casi è stato rilevato solo dalla CMA. Il restante 49% dei casi è stato rilevato sia dal CMA che dall’analisi cromosomica.

Il rilevamento del mosaicismo tramite CMA e quello tramite analisi cromosomica differiscono a causa della differenza nella tecnologia e nella popolazione cellulare analizzata. La CMA analizza il DNA estratto da tutte le cellule nucleate del sangue periferico, compresi più lignaggi cellulari. Al contrario, l’analisi cromosomica viene eseguita principalmente sui linfociti T stimolati dalla fitoemoagglutinina. Gli studi hanno dimostrato che la CMA può essere più sensibile quando le cellule anormali non rispondono ai mitogeni e/o le anomalie sono rare o assenti nelle cellule T, come nella sindrome di Pallister-Killian.5,6 Cinque casi di trisomia a mosaico, che coinvolgono i cromosomi 8, 9, 14 e 22, sono stati rilevati solo dal CMA.

Anche se il CMA può facilmente rilevare il mosaicismo a livelli del 30% o superiori, è limitato nel rilevare routinariamente il mosaicismo a livelli del <10%.6,13,14 Altre piattaforme di array, come gli array di polimorfismo a singolo nucleotide possono essere meglio in grado di rilevare il mosaicismo grazie alle informazioni ottenute dalle frequenze degli alleli B.15,16 L’analisi cromosomica può rilevare un mosaicismo di basso livello attraverso l’esame individuale di un gran numero di cellule. Gli studi cromosomici standard di 20 cellule escluderanno il 14% di mosaicismo al livello di confidenza del 95%. Più cellule possono essere esaminate quando vengono identificate una o due cellule anormali in metafase. Tuttavia, l’analisi di molte cellule individuali richiede tempo e lavoro. Se il mosaicismo è sospettato o confermato, la FISH può essere utilizzata per esaminare centinaia di singole cellule in interfase per determinare il livello di mosaicismo; la FISH richiede relativamente meno tempo rispetto all’analisi cromosomica.

Le anomalie mancate dal CMA, esclusi i riarrangiamenti apparentemente bilanciati, rappresentano < lo 0,2% dei casi totali in questo studio ( Tabella 2 ). La maggior parte dei casi non erano rilevabili dal CMA perché la percentuale di cellule anormali era inferiore al limite di rilevamento del CMA (<10%). Il significato clinico non è chiaro per il mosaicismo di livello molto basso nei casi 2 e 3, e il piccolo cromosoma marker che contiene esclusivamente sequenze di ripetizione pericentromerica nel caso 4. Le restanti anomalie mancate dal CMA sono associate ad anomalie fenotipiche. Non è chiaro perché l’anomalia vista nel 30% delle cellule coltivate nel caso 5 sia stata mancata dal CMA, ma è presumibilmente dovuta al fatto che le cellule anomale sono sovrarappresentate specificamente nelle cellule T. La presenza di due linee cellulari diverse con guadagni e perdite genomiche che coinvolgono la stessa regione ha portato a un equilibrio genomico netto per quella regione, sfuggendo così al rilevamento da parte del CMA, come mostrato nel caso 6.

Il rilevamento del mosaicismo da parte del CMA si basa sulla deviazione dai rapporti logici previsti per la delezione o duplicazione senza mosaicismo. Il sospetto mosaicismo deve essere confermato dall’analisi cromosomica su cellule coltivate o dall’analisi FISH, preferibilmente utilizzando strisci di sangue. In 11 casi studiati qui, il CMA è stato in grado di rilevare l’anomalia cromosomica, ma non è stato in grado di rilevare che il caso era mosaico a causa di una bassa percentuale di cellule normali o la presenza di un cromosoma isodicentrico che porta alla tetrasomia segmentale. Per esempio, due casi avevano un aumento del numero di copie rilevato da tutte le sonde per il cromosoma 18 mediante CMA ( Figura 2 ), suggerendo la trisomia 18. In realtà, l’analisi cromosomica ha mostrato che un caso aveva la trisomia 18 in tutte le cellule (Figura 2a), mentre l’altro caso aveva un mosaicismo per la trisomia 18 nell’80% delle cellule (Figura 2b). Inoltre, quando due o più linee cellulari anormali coinvolgono la stessa regione, come esemplificato nel caso della Figura 2c, l’analisi cromosomica e/o FISH è essenziale per una corretta interpretazione delle anomalie cromosomiche.

Le informazioni strutturali cromosomiche sono fornite dall’analisi cromosomica ma non sono evidenti dal CMA

Il CMA fornisce informazioni molto affidabili sulla presenza di guadagni e perdite di numero di copie ma non fornisce informazioni di posizione o orientamento. I nostri studi hanno mostrato che le anomalie strutturali sono state viste nel 18% dei casi di CMA anormale. Metà dei riarrangiamenti strutturali identificati in questo studio sono traslocazioni/inserzioni sbilanciate, un terzo sono altri cambiamenti strutturali come cromosomi ad anello, cromosomi marcatori, isocromosomi e cromosomi isodicentrici, e il restante 15% sono riarrangiamenti complessi. Dato che la maggior parte di queste aberrazioni strutturali coinvolgono regioni subtelomeriche, i cambiamenti del numero di copie terminali hanno una maggiore probabilità di avere ulteriori anomalie strutturali.17 In generale, sia l’analisi cromosomica che l’analisi FISH sono in grado di identificare traslocazioni, inserzioni, isocromosomi e marcatori, con diverse forze per ciascun metodo. Anche se la FISH può rilevare cambiamenti troppo piccoli per essere rilevabili dall’analisi cromosomica, l’analisi dei modelli di bandeggio cromosomico fornisce ulteriori informazioni sulle regioni coinvolte. Nel caso di riarrangiamenti complessi, la FISH combinata e l’analisi cromosomica possono essere necessarie per determinare completamente i complessi cambiamenti strutturali. Con questa eccezione, l’analisi FISH a seguito di un riscontro anormale tramite CMA è tipicamente adeguata a fornire informazioni sulla natura del cambiamento del numero di copie.

Alcuni riarrangiamenti cromosomici potrebbero essere mancati anche dopo CMA e FISH. Per esempio, una delezione interstiziale in 2q è stata rilevata dal CMA nel caso 9 (Figura 1a). Senza analisi cromosomica, il riarrangiamento sembra essere una semplice delezione singola anche dopo l’analisi FISH di conferma. Tuttavia, l’esame del cariotipo ha mostrato un cromosoma 2 anormale con un inserimento di un segmento da 17q23.1q23.3 nella banda 2p11.2. Inoltre, il cromosoma 2 con il segmento 17q inserito ha anche un’inversione pericentrica tra 2p12 e 2q31.1. La delezione su 2q31.1 rilevata dal CMA molto probabilmente si è verificata in corrispondenza o in prossimità del breakpoint di inversione sul braccio lungo di un cromosoma 2. In sintesi, il caso 9 aveva un riarrangiamento complesso che includeva una delezione in 2q rilevabile dal CMA ma non visibile dall’analisi cromosomica, così come un’inserzione e un’inversione che coinvolgevano i cromosomi 2 e 17, rilevabili dall’analisi cromosomica ma non dal CMA. Allo stesso modo, il caso 10 aveva riarrangiamenti de novo che coinvolgevano quattro cromosomi tra cui un’inserzione del segmento 2q14.2q24.1 al braccio corto di un cromosoma 6, che ha anche un’inversione paracentrica, e una traslocazione reciproca tra i cromosomi 12 e 18. Le perdite di numero di copie sono state identificate dal CMA vicino ai breakpoint nei cromosomi 2 e 6 (Figura 1b). Una diagnosi corretta richiede la combinazione di CMA e analisi cromosomica.18

L’identificazione dei riarrangiamenti strutturali cromosomici è indispensabile per la consulenza genetica della famiglia. Gli squilibri genomici rilevati dal CMA potrebbero essere dovuti a un prodotto di segregazione sbilanciato di una traslocazione o inserzione bilanciata in un genitore e, quindi, giustifica una forte raccomandazione per eseguire studi parentali. Inoltre, le informazioni strutturali cromosomiche forniscono una guida per quali studi parentali dovrebbero essere raccomandati. Per i riarrangiamenti che sono probabilmente prodotti di un riarrangiamento bilanciato, il FISH parentale o l’analisi cromosomica dovrebbero essere eseguiti invece del CMA parentale.

Riarrangiamenti apparentemente bilanciati con uno studio CMA normale

In questo studio, singole traslocazioni o inversioni apparentemente bilanciate senza altre anomalie cromosomiche sono state rilevate in 30 casi (~0,8%) mediante analisi cromosomica. È stato riportato che ~40% dei pazienti con anomalie congenite multiple/ritardo mentale e una traslocazione de novo apparentemente bilanciata hanno anomalie criptiche vicino ai punti di rottura, o non collegate ai punti di rottura, che possono essere facilmente rilevate dal CMA.19,20 Tuttavia, il CMA non ha rilevato alcun cambiamento del numero di copie vicino ai punti di rottura in questi 30 casi. Diversi fattori possono contribuire a questa osservazione. La maggior parte dei riarrangiamenti sono stati ereditati sulla base degli studi dei genitori di un sottogruppo di casi, il che significa che è più probabile che siano “veramente” bilanciati. Inoltre, le traslocazioni Robertsoniane, che di solito non risultano in cambiamenti del numero di copie dell’eucromatina, sono state incluse in questo studio ma escluse negli studi pubblicati. Inoltre, piccole delezioni/duplicazioni criptiche adiacenti ai punti di rottura possono essere mancate perché gli array utilizzati per la maggior parte di questi casi erano mirati e non avevano una risoluzione genomica sufficiente per rilevare uno squilibrio.

Anche se la maggior parte dei riarrangiamenti bilanciati sono benigni, i riarrangiamenti de novo sono associati a un rischio di malattia più elevato a causa di una delezione o duplicazione criptica, una rottura del gene o dell’enhancer, effetti di posizione o effetti epigenetici. Il rischio di avere una grave anomalia congenita per traslocazioni e inversioni reciproche de novo è del 6,7%.21 Il rischio dovrebbe essere più basso per i casi con un CMA normale utilizzando un whole-genome array. Pertanto, i semplici riarrangiamenti bilanciati rilevati in questo studio hanno meno probabilità di essere la causa dei fenotipi dei pazienti.

Strategia basata sull’evidenza per una rilevazione efficiente delle anomalie cromosomiche

Per determinare se e quando l’analisi cromosomica debba essere eseguita per la diagnosi clinica delle anomalie cromosomiche, abbiamo esaminato i risultati dei casi studiati contemporaneamente sia con la CMA che con l’analisi cromosomica. Anomalie cromosomiche rilevate dall’analisi cromosomica ma completamente mancate dalla CMA sono state osservate in ~1% dei casi, compresi riarrangiamenti apparentemente bilanciati nello 0,8% dei casi e squilibri associati a mosaicismo nello 0,16% dei casi. Inoltre, l’analisi cromosomica ha facilitato l’individuazione di riarrangiamenti strutturali cromosomici nel 18% dei casi con risultati CMA anormali.

Anche se il CMA fornisce informazioni sulla variazione del numero di copie e sul mosaicismo, solo l’analisi cromosomica o la FISH fornisce le informazioni strutturali cromosomiche associate a questi cambiamenti del numero di copie e identifica alcuni casi di mosaicismo non rilevati dal CMA. I vantaggi della FISH rispetto all’analisi cromosomica è che i piccoli (<3-10 Mb) cambiamenti del numero di copie possono essere rilevati e un gran numero di nuclei può essere analizzato rapidamente, il che è particolarmente utile per la valutazione del mosaicismo. Pertanto, dopo un CMA anormale, l’analisi FISH può essere applicata prima per rilevare i riarrangiamenti strutturali associati ai cambiamenti del numero di copie e confermare il mosaicismo e determinare la percentuale di cellule anormali. Quando inserzioni o traslocazioni sono rilevate dalla FISH, l’analisi cromosomica può essere indicata per determinare i cromosomi coinvolti. Invece dell’analisi cromosomica standard, che studia 20 cellule in metafase da due colture, un’analisi cromosomica su piccola scala di cinque cellule da una cultura è sufficiente per questo scopo. Questa strategia rileverebbe tutti i cambiamenti strutturali ad eccezione di alcuni rari riarrangiamenti complessi.

Per i casi con un risultato normale da CMA, un’analisi cromosomica completa può essere considerata se il paziente ha anomalie congenite multiple, caratteristiche dismorfiche e/o ritardo mentale che ricordano una sindrome cromosomica o manifestazioni cliniche indicative di potenziale mosaicismo come anomalie pigmentarie che sono distribuite in modo casuale o che seguono le linee di Blashko e asimmetria di crescita in associazione con disabilità intellettuale. Sulla base di questo studio, ~1% dei casi avrebbe risultati cromosomici informativi, ma <0,001 dei casi (3/3.710) avrebbe un risultato clinicamente significativo.

In sintesi, il nostro studio conferma ulteriormente che quasi tutte le anomalie cromosomiche rilevabili dall’analisi cromosomica sono rilevate dalla CMA, sostenendo la raccomandazione che la CMA sia il test di primo livello. Tuttavia, l’analisi citogenetica tradizionale rimane utile per l’individuazione del mosaicismo e la caratterizzazione dei riarrangiamenti strutturali.