Una produzione sessuale di organismi geneticamente identici è nota come clonazione che comporta la divisione di un singolo embrione, sia i geni nucleari che il piccolo numero di geni mitocondriali sarebbero “identici”, o può coinvolgere il trasferimento nucleare, nel qual caso solo i geni nucleari sarebbero “identici”. Dopo una lotta di molti anni, nel 1995 gli scienziati hanno clonato due agnelli “Megan e Morag” al “Roslin Institute” in Scozia e sono stati clonati da cellule di un embrione precoce,1 anche se gli anfibi erano già stati clonati con successo negli anni ’50. Dopo di che è stato riferito che un certo numero di agnelli erano nati dalla clonazione. Nel febbraio 1997, dopo 277 tentativi, fu clonato un agnello chiamato “Dolly”, la cui durata di vita era molto superiore a quella di altri agnelli clonati.2 La clonazione di Dolly annunciò l’inizio di un nuovo periodo in agricoltura con la possibilità di proteggere e moltiplicare rapidamente genotipi selezionati.3 Fino ad oggi molti animali sono stati clonati per trasferimento nucleare in mammiferi come pecore, capre, bovini, conigli, topi.4 La clonazione ha molte applicazioni e facilita la rapida propagazione di stock animali desiderabili, la propagazione di bestiame transgenico, alterazioni genetiche mirate negli animali domestici e la conservazione delle specie in pericolo.1 Ma alcune questioni sono ancora irrisolte, come le questioni etiche e morali, e le basse percentuali di successo con il trasferimento nucleare di cellule somatiche a causa di errori epigenetici come risultato di una programmazione nucleare imprecisa,5 tutti i fattori hanno limitato la soddisfazione e l’applicabilità della clonazione in agricoltura.
La limitazione della clonazione è dovuta alla complessa interazione di molte ragioni come il benessere degli animali e la mancanza di fiducia nella salute a lungo termine degli animali clonati.6 Durante l’uso della tecnica di clonazione la maggior parte degli embrioni apparentemente di buona qualità non riescono a fiorire durante la gravidanza o dopo la nascita.7 Il fallimento nella riprogrammazione del nucleo donato è la causa principale del flop a causa della sua importanza nel corretto modello di espressione genica che si verifica durante la successiva embriogenesi.8 Questa riprogrammazione deve avvenire in tempi brevi, in un contesto cellulare diverso rispetto allo sviluppo normale, ed è soggetta a errori. Ci sono sempre più dati che documentano deviazioni nella riprogrammazione epigenetica.9
Il tasso di fallimento della clonazione è molto alto,10 molti embrioni clonati possono svilupparsi fino allo stadio preimpianto, ma la stragrande maggioranza non risulterà in una gravidanza vitale.11 Nonostante l’uso di femmine sincrone sane e fertili come destinatarie, è stato riportato che il 50% delle perdite si è verificato durante il primo trimestre e circa l’80% abortisce entro il secondo trimestre, soprattutto a causa di anomalie della placenta.12 Secondo gli studi su mucche e pecore, il periodo più drammatico della perdita fetale è al momento dell’attacco della placenta.4 Dopo aver completato la gestazione gli animali clonati hanno maggiori difficoltà ad adattarsi alla vita extra uterina,13 hanno un aspetto normale ma sono geneticamente diversi e queste differenze sono dovute ad anomalie epigenetiche acquisite durante la riprogrammazione nucleare.10 Molte anomalie gestazionali e neonatali sono stati trovati in animali clonati,12 che è può essere dovuto espressione irregolare e probabilmente incompleta riprogrammazione dei geni imprinted.14 Secondo alcune altre relazioni la differenza è dovuta anomalie nella lunghezza dei telomeri, espressione genica o modelli di metilazione.4
Un altro problema che si trova in animali clonati è anomalie placentari. Secondo molti scienziati la morte precoce dell’embrione è dovuta allo scarso sviluppo della placenta. Nell’animale clonato è stato riportato uno sviluppo anomalo della membrana allontoica e un ridotto sviluppo dei vasi sanguigni placentari, il numero di placentomi è inferiore nell’animale clonato15 e sembra che la capacità di scambio di gas della placenta sia significativamente ridotta, dato che i feti clonati a fine gestazione sono risultati ipossici.16
La vitalità post-natale della prole clonata è più bassa nell’animale clonato ma dipende dall’animale.17 Nel post-natale i vitelli hanno mostrato soprattutto problemi respiratori18 cardiovascolari, scheletrici e del sistema nervoso centrale.7 Il potenziale per gli effetti degli errori epigenetici sulla composizione degli animali clonati è il motivo per cui la sicurezza dei prodotti alimentari derivati ha avuto un grande ostacolo nell’ottenere l’approvazione normativa per l’ingresso nella catena alimentare.
Anomalie epigenetiche
Epigenetica significa ”lo studio dei cambiamenti mitotici e/o meiotici ereditabili nella funzione genica che non possono essere spiegati dai cambiamenti nella sequenza del DNA.19 Secondo la teoria il clone e l’animale donatore dovrebbero avere lo stesso genoma, ma non è probabile che i mammiferi clonati mostrino occasionalmente anomalie di sviluppo dovute a errori epigenetici.20 A volte la crescita eccessiva della placenta e del feto, definita come “sindrome della prole grossa “15 , altre anomalie, tra cui difficoltà respiratorie, gravi anomalie cardiovascolari e l’allargamento degli organi, sono comunemente osservate nei ruminanti clonati21 , ecco perché l’applicabilità della clonazione in agricoltura è molto limitata.22
Il risultato pratico è che ci sono molti animali clonati che si comportano e sembrano normali, mentre indagini più approfondite hanno rivelato che anche alcuni di questi animali apparentemente normali sono sottilmente diversi dalla popolazione prodotta naturalmente.23 Nella clonazione, quando la cellula somatica viene trasferita dal donatore al ricevente, in quel momento il nucleo della cellula somatica deve essere rapidamente riprogrammato per assumere la sua nuova vita di cellula embrionale.24 In ogni caso, se la cellula non è in grado di riprogrammare o in completa riprogrammazione, porta ad uno sviluppo abortivo e possibilmente ad anomalie non letali nei cloni sopravvissuti.4 Alcuni geni sono espressi correttamente negli embrioni clonati, come importanti enzimi metabolici, ma l’espressione di qualche altro gene è per lo più anormale e influenza la vita futura del clone. In tali condizioni la maggior parte dei cloni ha apparentemente sperimentato una gravidanza normale e un periodo neonatale, le prospettive di una vita normale sembrano buone, ma lo sviluppo della placenta e l’ambiente intrauterino per molti cloni è subottimale e questo da solo può avere un impatto sulla loro salute nella vita successiva.25
La metilazione del DNA gioca un ruolo importante nell’espressione genica che controlla lo sviluppo animale.5 È stato riportato che gli errori epigenetici principalmente nei modelli di metilazione del DNA e l’organizzazione della cromatina nell’embrione clonato.19 Spesso, il modello cellulare donatore di metilazione del DNA viene mantenuto durante lo sviluppo pre-impianto14 che portano alla riprogrammazione degli effetti e che causano placentazione anormale.26 Secondario che è una ragione importante per il basso tasso di natalità.24
Anomalie placentari
Placenta è organo principale di contatto materno-fetale, gioca un ruolo vitale nel mantenimento della gravidanza, e mantiene il feto soddisfacendo partizione positiva di nutrienti e funzioni endocrine critiche. La sopravvivenza e lo sviluppo del feto durante la gravidanza dipendono da un adeguato sviluppo morfologico e funzionale della placenta. La clonazione è sempre associata ad anomalie della placenta e le indicazioni di fallimento della placenta nelle gravidanze a trasferimento nucleare includono anomalie come la sindrome della prole grande, proteine di membrana placentare e fetale alterate, aumento del peso della placenta e allargamento del placentoma ed edema nei bovini.27 L’idroallantoide è stata classificata da Farin come una condizione di sindrome della prole anormale di tipo II in questa condizione patologica della placenta il fluido fetale aumenta e crea difficoltà nel localizzare il feto all’interno del corno uterino.27
Nelle prime gravidanze di animali clonati il tasso di morte fetale è vicino a circa l’80%26 che è principalmente dovuto al malfunzionamento e al sottosviluppo della placenta.15 Tipicamente, nei bovini, il 50-70% delle gravidanze al 50° giorno sono perse per tutto il resto della gestazione e fino al termine a causa della mancanza di vascolarizzazione placentare e siti di attacco che sono importanti per lo scambio di nutrienti e prevenire il feto dalla condizione ipossica.7 Nel terzo trimestre delle vacche gravide con feti clonati; sono state riportate anche alcune anomalie della placenta, come l’edema e l’idroallantoide con probabilità di verificarsi intorno al 45%.28 La condizione di idroallantoide si osserva più comunemente tra i giorni 150 e 180 delle gravidanze clonate.28 Secondo la ricerca la disfunzione e l’allargamento della placenta possono essere dovuti alle proteine della placenta che hanno mostrato una sovraespressione di TIMP-229 ma secondo altri può essere dovuto all’alterazione dell’espressione genica nel trofoblasto della placenta clonata.30
Difficoltà nel parto
Attualmente, la clonazione ha generalmente una bassa efficienza, a causa di molti fattori, come la riprogrammazione del nucleo, la differenziazione delle cellule donatrici e la situazione dell’ovocita.31 Il periodo di riprogrammazione è la fase chiave per ottimizzare la clonazione.32 In quel periodo, se la riprogrammazione non avviene correttamente, allora porta ad anomalie epigenetiche e aumenta il tasso di mortalità. e i vitelli clonati somatici sono apparentemente più pesanti dei cloni embrionali33 , che è anche un esempio di anomalie epigenetiche che aumentano le complicazioni della nascita.13 Il feto di grandi dimensioni, comprese tutte le anomalie neonatali dovute all’errore epigenetico, viene definito “sindrome del vitello grande”.34 E’ comune che la lunghezza della gestazione nelle gravidanze a trasferimento nucleare sia molto prolungata, questo è dovuto al fallimento della placenta nel rilasciare cortisolo al feto vicino al termine o alla mancanza di rilascio di ACTH da parte del feto.26 Lo squilibrio ormonale e le grandi dimensioni del feto sono il passo verso la distocia, oltre ai relativi problemi post-partum possono anche avere gravi effetti negativi sulla salute della fattrice così come sulla sua futura produzione e performance riproduttiva nella mandria.7
Vitabilità pre e postnatale
L’embrione è considerato di buona qualità se il numero di cellule è abbastanza buono perché è un criterio importante che verifica la fattibilità dell’embrione dopo il trasferimento in una madre surrogata quindi il basso numero di cellule nell’embrione clonato sarà collegato con una bassa percentuale di sopravvivenza dopo il trasferimento embrionale in diverse specie.35 Gli embrioni bovini clonati con una percentuale più alta di blastomeri apoptotici hanno mostrato un tasso di gravidanza più basso dopo 90 giorni dal trasferimento dell’embrione e successivamente un tasso di parto più basso.36
La vitalità postnatale è nettamente inferiore per molti clonati.37 La percentuale di vitelli clonati nati che sono sopravvissuti a lungo termine varia tra il 47% e l’80%.38 Alla nascita, i vitelli e gli agnelli clonati mostrano comunemente segni di un ambiente uterino stressante; la capacità di riserva placentare è molto probabilmente limitata a causa di uno sviluppo inadeguato.7 È evidente che la vitalità fetale negli animali clonati varia tra gli esperimenti e tra le specie, con topi e capre clonati che mostrano una migliore vitalità post-natale che può essere dovuta alla tecnica, al ceppo animale o al tipo di placenta.26 Alcuni altri casi sono stati riportati anche riguardo al cordone ombelicale di vitelli clonati che può essere una potenziale via di morte nel post-natale.39 Nei vitelli clonati le vene e le arterie ombelicali allargate sono anche importanti cause di morte nel post-natale a causa di sepsi nelle strutture ombelicali.39
Secondo le nuove ricerche i problemi vascolari sono anche una causa di morte post-natale come l’ipertensione polmonare, le lesioni, l’edema e i versamenti pleurici, oltre alla congestione capillare dei setti alveolari e la trombosi polmonare che causano disturbi emodinamici. Queste alterazioni hanno probabilmente inibito la completa espansione alveolare e spiegato l’insufficienza polmonare che ha contribuito al basso tasso di sopravvivenza post-natale dei vitelli clonati.40 Questi problemi di sviluppo vascolare sono risultati come alterazioni primarie o chiave dovute a modifiche epigenetiche causate dalla clonazione.
Anche se queste particolari aberrazioni epigenetiche possono essere minori e non un problema di benessere per l’animale, esse possono limitare alcune applicazioni pratiche della tecnologia perché diminuiscono la potenziale uniformità del bestiame clonato.41 Un fenotipo del clone ben noto alle specie diagonali è la conferma di sistemi immunitari compromessi, con aplasia timica nel bestiame clonato e minore produzione di anticorpi nei topi clonati.26 I sistemi immunitari compromessi possono aumentare la loro propensione alle infezioni e alle malattie.9
Nel post-natale i campioni di sangue raccolti dagli agnelli clonati dopo la nascita hanno rivelato una vasta gamma di anomalie indicative di disfunzioni renali ed epatiche.32 Ulteriori perdite nel periodo post-natale sono dovute principalmente ad anomalie del sistema cardiovascolare, scheletrico e nervoso centrale, infezioni ombelicali e polmonari, insieme a disturbi digestivi e renali.7 Le perdite post-natali nelle pecore sono maggiori rispetto ai bovini.26
Fenotipi di cloni adulti
Se i modelli di espressione dei geni sono anormali al momento del pre-impianto e nelle prime fasi dell’impianto, allora anche la morfologia del clone sarà anormale.42 Nella maggior parte dei casi il clone ha un aspetto normale e ha una fisiologia normale, ma sono ancora presenti molti rapporti che mostrano le anomalie associate al fenotipo,41 come la “sindrome della prole grande”.9 Ciò è dovuto a un errore nell’espressione genica della crescita e dello sviluppo fetale.43 L’incidenza di queste anomalie può variare a seconda della specie, del genotipo, del sesso, del tipo di cellula o di aspetti particolari del protocollo di trasferimento nucleare.4
Alto tasso di fallimento
Una barriera all’uso pratico delle tecniche che coinvolgono il trasferimento nucleare di cellule somatiche è la bassa possibilità di ottenere embrioni clonati; solo pochi per cento degli ovociti ricostruiti sono sempre capaci di svilupparsi.43 Fino ad ora il tasso di successo se la clonazione di intra specie è 1%44 nonostante l’uso di destinatario sano e sincronizzare oltre ad esso buona qualità dell’embrione utilizzato. Nella maggior parte delle specie di mammiferi, la valutazione della morfologia embrionale rimane il metodo di selezione per la varietà di embrioni praticabili prima del trasferimento. È il modo più realistico e clinicamente utile per valutare la vitalità dell’embrione.14 Ma ancora la maggior parte dei casi significativa perdita di gravidanza è riportato nelle prime fasi di sviluppo circa all’età di 30-90 giorni di gestazione45 a causa di fallimento della membrana placentare e ridurre lo sviluppo dei vasi placentari,39 è stato riferito che i tassi di gravidanza primo trimestre sono meno di 1/2 che normalmente previsto, la perdita embrionale è molto alta e vicino a circa 80% abortire dal secondo trimestre in aggiunta gestazione tardiva alto livello di probabilità di sviluppare anomalie placentari e fatale poi normale.7 La causa principale delle perdite nel terzo trimestre sono l’idroallantoide e l’idrope fetale, solitamente attribuite ad una placentazione inadeguata.16 È anche presente in letteratura che la perdita del feto clonato è anche dovuta alla condizione ipossica perché nell’animale clonato il numero di placentomi è inferiore e ciò è in grado di scambiare meno sostanze nutritive dalla diga al feto e creare una condizione sfavorevole per lo sviluppo del feto.15
L’alto tasso di perdita della gravidanza e di morte neonatale dei vitelli clonati è dovuto alla riprogrammazione nucleare incompleta; diversi autori hanno confermato in modo convincente che la cellula somatica del donatore è riprogrammata in modo tale che il modello di espressione allo stadio di blastocisti è significativamente diverso da quello della cellula somatica prima del trasferimento nucleare.46 Secondo Arnold et al.,47 l’espressione dei geni critici per il normale sviluppo placentare è malformata negli embrioni bovini clonati, e questo probabilmente causa una differenziazione anomala dei trofoblasti e contribuisce alla perdita della gravidanza. Anche la prole in corso hanno grandi placente e aumento del peso alla nascita, noto come sindrome della prole grande14 e alcuni con un aspetto apparentemente sano subiscono da disfunzioni immunitarie, portando ad un aumento della mortalità.24
Secondo un rapporto di Marfil et al.48 in vitelli clonati Distress respiratorio 19% e in quella condizione vitelli morti senza alcun altro segno di anormalità. Un cordone ombelicale ingrossato 37%, iper/ipotermia 17% e reclinazione depressa/prolungata 20% sono le cause più comuni di morte tra le 24 e i 60 giorni dopo la nascita. I problemi che possono abbassare la sopravvivenza di questi vitelli al momento o intorno al momento della nascita includono l’aumento della lunghezza della gestazione, una grave distocia, un insufficiente sviluppo e funzione della placenta, e fallimenti nelle vie metaboliche necessarie per la vita extra-uterina e alcuni problemi congeniti come ipoplasia cerebellare, distress respiratorio e allargamento del cuore.4
Può essere normale che i cloni abbiano una diversa sensibilità allo stress rispetto agli animali conservatori a causa di ciò sono più soggetti agli agenti patogeni che possono anche aumentare il tasso di morte dei cloni.23 Per prevalere sulla bassa efficienza della clonazione, sono stati provati vari metodi diversi come l’uso di diversi tipi di linee cellulari donatrici, una varietà di sistemi di coltura, diversi metodi di fusione e sostanze chimiche.35 Alcuni di questi sforzi di ricerca hanno portato a piccoli miglioramenti nella qualità degli embrioni clonati, che è strettamente legata allo sviluppo embrionale e alla produttività della prole.
Etica
La clonazione di animali è la chiave dello sviluppo nel campo dell’agricoltura e della medicina, ma è accettabile solo quando gli scopi e i metodi sono eticamente giustificati e quando è effettuata in condizioni etiche. Gli scienziati stanno facendo un’ampia ricerca nella clonazione animale, ma ora vengono sollevate molte questioni etiche. La notevole inefficienza della clonazione pone serie minacce al benessere degli animali.49 Spesso, meno dell’uno per cento dei tentativi di clonazione risulterà in una nascita di successo, e di quelli che nascono, solo una percentuale relativamente piccola è abbastanza sana da vivere per più di pochi giorni o settimane.35 Secondo un sondaggio, il 64% degli americani sono contrari alla clonazione e pensano che sia contro il benessere degli animali, per questo è moralmente sbagliato.50
Durante la clonazione il risultato etico più grave è il dolore che gli animali soffrono durante il processo, oltre ad esso la clonazione ha anche effetti su altre popolazioni di animali. A causa di ciò anche gli esseri umani possono essere gravemente colpiti dalla clonazione animale compromettendo la sicurezza del bestiame usato nella produzione alimentare.51 La clonazione ha un effetto negativo sia sul donatore che sul ricevente perché nella clonazione in primo luogo viene fatto un intervento chirurgico per rimuovere l’uovo dal donatore e poi di nuovo un intervento chirurgico sul ricevente per impiantare l’uovo con meno possibilità di ottenere un obiettivo, inoltre se l’animale completa con successo la sua lunghezza di gestazione, a causa di qualche motivo sconosciuto il peso elevato della prole17 ha bisogno di un cesareo, a causa del quale l’animale soffre ancora di dolore.
Sono stati riportati anche altri problemi in cui l’animale soffre e che sono contro il benessere degli animali come l’idroallantoide, la condizione tipicamente fatale in cui l’animale incinta si gonfia di liquido al punto da sembrare che stia per scoppiare.48 È chiaro che gli embrioni prodotti dal trasferimento nucleare possono portare in alcuni casi ad uno sviluppo fetale instabile, e ad una maggiore incidenza di distocia, sectio caesarea e morte perinatale, che può avere effetti negativi sul ricevente e sulla prole; tutte queste cose cumulativamente sollevano difficoltà morali.52 La biodiversità è una rete di sicurezza che protegge dalla diffusione delle malattie negli animali, ma la clonazione è uno sforzo per fissare una serie di geni desiderabili e creare copie esatte dell’animale di origine, il che è contrario alla diversità e solleva anche una serie di questioni etiche.53
Sicurezza alimentare
Ogni paese ha un dipartimento speciale che si occupa del prodotto alimentare prodotto da una biotecnologia. Tuttavia i prodotti della biotecnologia animale devono passare attraverso valutazioni di sicurezza che vengono eseguite prima dell’accettazione pubblica e governativa del loro uso per il consumo umano.23 La possibile capacità di errori epigenetici di cambiare la composizione del cibo è il motivo per cui i prodotti alimentari derivati da animali da allevamento clonati sono stati un grande ostacolo nell’ottenere l’approvazione normativa per l’ingresso dei prodotti clonati nella catena alimentare. Inoltre, una prova di alimentazione nei ratti ha confermato che l’utilizzo di carne da animali clonati non ha avuto alcun effetto sulla crescita del corpo, l’assunzione di cibo, la condizione generale, l’attività dei locomotori, i riflessi, il ciclo sessuale, l’analisi delle urine, l’ematologia, la biochimica del sangue, o l’istologia.23 Dato che la tecnologia è ancora considerata nuova e poco familiare, oltre alla mancanza di qualsiasi prodotto con benefici diretti per il consumatore di oggi, non è scioccante che l’accettazione attuale sia bassa. Tuttavia, la maturazione della tecnologia e la disponibilità di tali prodotti in combinazione con l’invecchiamento della popolazione nel mondo occidentale sviluppato, con un forte desiderio di rimanere in salute più a lungo, potrebbe alla fine aumentare l’accettazione.54