B. Epitopi delle cellule B
Riimitiamo la nostra discussione agli epitopi delle cellule B su proteine e peptidi; gli epitopi su altri biopolimeri e gruppi aptenici non sono trattati. La prima importante generalizzazione sugli epitopi delle cellule B è che essi sono diretti contro le caratteristiche tridimensionali della superficie molecolare delle proteine e dei polipeptidi. Una particolare topologia tridimensionale è un segno distintivo degli epitopi delle cellule B rispetto agli epitopi delle cellule T. È probabile che qualsiasi residuo aminoacidico accessibile dalla superficie di una proteina possa essere parte di uno o un altro epitopo delle cellule B (Benjamin et al., 1984). Quindi, le proteine possono contenere moltissimi epitopi diversi anche se, per ragioni steriche, solo un numero limitato di anticorpi può legarsi all’antigene in qualsiasi momento. La risposta delle cellule B è stereospecifica, essendo molto più debole contro gli enantiomeri d dei peptidi (Gill et al., 1963) e delle proteine (Dintzis et al., 1993), forse perché le proteine d-enantiomeriche non vengono processate in modo efficiente per produrre peptidi per l’aiuto delle cellule T.
Prima si credeva che le proteine avessero una struttura antigenica ben definita caratterizzata da un numero limitato di epitopi. La comprensione della natura complessa della risposta immunitaria delle cellule B e della sua regolazione, e della specificità degli anticorpi monoclonali contro le proteine, ha reso chiaro che una proteina non possiede una struttura antigenica definita. Non è possibile definire la “struttura antigenica completa” di una proteina, contrariamente a quanto sostenuto da alcuni ricercatori (Atassi e Lee, 1978; Atassi, 1984). L’antigenicità di una proteina è sia una proprietà della topografia proteica che dei meccanismi di regolazione del sistema immunitario dell’ospite, compresa la tolleranza alle strutture che assomigliano alle proteine dell’ospite, la specificità dell’aiuto delle cellule T e le reti idiotipiche (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). I siti immunodominanti, cioè i siti verso cui sono diretti la maggior parte ma non tutti gli anticorpi della risposta immunitaria, non sono una proprietà intrinseca di per sé della proteina. Come sottolineato da altri in precedenza, gli epitopi non esistono di per sé, ma solo in virtù di una connessione con il sito di legame anticorpale complementare, il cosiddetto paratopo (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Quindi, un epitopo è un concetto relazionale, e la definizione di un epitopo è necessariamente operativa (Van Regenmortel, 1986). In altre parole, la definizione di un particolare epitopo dipende in larga misura dalla geometria molecolare e dalla natura chimica del paratopo corrispondente e, forse ancora più importante, dall’approccio sperimentale scelto per mappare l’epitopo.
Questo stato di cose può essere illustrato dall’esempio del primo complesso proteina-anticorpo la cui struttura è stata risolta dalla cristallografia a raggi X (Amit et al., 1986). In questo complesso, 16 residui di lisozima contattano 17 residui di un Fab monoclonale (frammento di anticorpo) al lisozima. L’epitopo si estende su 750 Å2 della superficie del lisozima. Al contrario, la mappatura dell’epitopo con una serie di lisozimi aviari correlati alla sequenza indica che solo alcuni residui sono importanti per il legame del lisozima agli anticorpi monoclonali antilisozima. La mutazione di pochissimi residui può ridurre radicalmente la costante di associazione del complesso lisozima-anticorpo (Harper et al., 1987). In un caso, una singola sostituzione da Arg a Lys ha ridotto di due ordini di grandezza l’affinità del lisozima per un anticorpo monoclonale (Smith-Gill et al., 1982). I calcoli teorici basati sulle strutture cristalline di due complessi di lisozima con frammenti Fab hanno dimostrato che, dei molti residui che definiscono l’epitopo nel cristallo, solo pochi contribuiscono effettivamente alla stabilità del complesso (Novotny et al., 1989). Sulla base dei loro calcoli, Novotny et al. hanno distinto tra un epitopo energetico e un epitopo passivo. L’epitopo energetico comprende quei residui che contribuiscono all’energia del legame. L’epitopo passivo fornisce solo la complementarità di superficie intorno ai residui che formano l’epitopo energetico. Che solo alcune delle interazioni viste nella struttura cristallina giocano un ruolo importante nella stabilizzazione del complesso antigene-anticorpo è stato confermato per il legame della neuraminidasi del virus dell’influenza a un anticorpo monoclonale. Diciannove residui della neuraminidasi contattano 17 residui dell’anticorpo nel cristallo, ma la mutazione sito-specifica di soli 3 residui abolisce totalmente il legame (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
Una distinzione operativa più generalmente applicabile degli epitopi è quella tra un epitopo di contatto e un epitopo funzionale. L’epitopo di contatto si riferisce alle informazioni ottenute dalla struttura tridimensionale del complesso antigene-anticorpo; l’epitopo funzionale si riferisce alle informazioni provenienti da procedure di mappatura non cristallografica, compresa la mappatura dell’epitopo con i peptidi. Un epitopo di contatto è rappresentato da una corrispondenza tra grandi aree di superficie complementari dell’antigene e dell’anticorpo, come visto in diverse strutture a raggi X di complessi proteina-anticorpo (Davies e Padlan, 1990; Wilson e Stanfield, 1994; Braden e Poljak, 1995). Gli epitopi di contatto coprono diverse centinaia di angstrom quadrati di superficie molecolare. L’epitopo funzionale definisce i residui che sembrano significativi per il legame anticorpale e la cui mutazione può ridurre o abolire totalmente il legame. L’epitopo funzionale può comprendere anche solo 2 o 3 residui, come negli esempi del lisozima e della neuraminidasi menzionati sopra. Non è possibile dedurre l’epitopo di contatto dall’epitopo funzionale. Allo stesso modo, l’epitopo di contatto non rivela da solo l’epitopo funzionale. Da parte dell’anticorpo, si possono anche differenziare due tipi di paratopi: un paratopo funzionale e un paratopo di contatto. Questo segue dall’analisi termodinamica delle regioni che determinano la complementarità di un anticorpo monoclonale (Kelley e O’Connell, 1993).
La doppia natura di un epitopo come rivelata dalla cristallografia e dalle tecniche di mappatura non cristallografica riflette due diversi modelli di riconoscimento molecolare. Vista in questo modo, la difficoltà di definire la natura degli epitopi è spostata al livello di una difficoltà epistemologica: come possiamo modellare la realtà con i ristretti mezzi sperimentali a nostra disposizione? Questi limiti saranno tenuti in considerazione quando si parlerà della mappatura degli epitopi da parte dei peptidi.
Qui dobbiamo menzionare la classificazione concettuale degli epitopi delle cellule B, nota da tempo, in sequenziale e conformazionale (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi e Smith, 1978). Un epitopo è detto sequenziale o continuo se può essere rappresentato da una serie di residui contigui di una catena polipeptidica. Si dice che un anticorpo riconosce un epitopo sequenziale se reagisce con un peptide corto e flessibile o con la catena polipeptidica denaturata e dispiegata. Un epitopo conformazionale, chiamato anche discontinuo o topografico o assemblato, è costruito da parti non contigue della sequenza aminoacidica attraverso il ripiegamento della catena polipeptidica nella proteina nativa. Si dice che un anticorpo riconosce un epitopo conformazionale se reagisce con una proteina nativa e non con la catena polipeptidica dispiegata, o se reagisce con un peptide di conformazione unica, per esempio, un’elica, ma non con un peptide a bobina casuale.
La distinzione tra epitopi sequenziali e conformazionali è in qualche modo arbitraria e può essere fuorviante. Poiché ogni paratopo ha una struttura tridimensionale ben definita, l’interazione tra paratopo ed epitopo è sempre un adattamento di strutture nello spazio tridimensionale. Questo vale sia per un epitopo su una proteina globulare ben ordinata che per un epitopo su un peptide corto e flessibile. In quest’ultimo caso, il peptide deve anche adottare una conformazione unica quando si lega all’anticorpo; quindi, un epitopo continuo è anche “conformazionale”. La conformazione di legame o preesiste o è indotta dal paratopo (vedi sezioni V,B e V,C).
Nel caso degli anticorpi contro le proteine native, è stato sostenuto che la maggior parte o forse tutti gli epitopi sono discontinui (Barlow et al., 1986). A causa delle grandi dimensioni di un tipico epitopo di contatto in un cristallo antigene-anticorpo, è infatti improbabile che un anticorpo si leghi esclusivamente a un tratto contiguo della catena polipeptidica e non anche a residui di contatto distanti in sequenza ma vicini nello spazio. I modelli di riempimento dello spazio delle proteine mostrano pochi tratti lineari più lunghi di 4 o 5 residui in legame peptidico diretto accessibili sulla superficie della molecola. Questo non vuol dire che un anticorpo diretto contro un epitopo assemblato sulla superficie di una proteina non possa reagire in modo incrociato anche con un peptide corrispondente a un segmento della proteina.
Concludendo la nostra panoramica sulla natura degli epitopi delle cellule B, sottolineiamo ancora una volta la difficoltà di dare una definizione generale di “epitopo”. Un ricorso pragmatico alle definizioni operative può non piacere ai puristi, ma le definizioni operative possono essere utili per rispondere alle domande sul carattere di una particolare interazione antigene-anticorpo.