Il design del gene, la tecnologia di fusione e le condizioni di scissione TEV influenzano la purificazione dei peptidi del veleno ricchi di disolfuro ossidato in Escherichia coli

L’uso dei codoni dei geni che codificano i peptidi del veleno causano differenze di espressione

Ventiquattro geni di varia lunghezza che codificano peptidi del veleno di specie diverse e che contengono un numero diverso di ponti disolfuro sono stati scelti per esplorare gli effetti dell’uso dei codoni sui livelli solubili delle proteine purificate. Questi geni codificano peptidi del veleno che sono evolutivamente, strutturalmente e funzionalmente diversi. L’esperimento mira a valutare se sottili cambiamenti nell’uso del codone possono influenzare i livelli di espressione del peptide ricombinante in E. coli. Tre varianti di ogni gene sono state inizialmente progettate ritraducendo le sequenze dei peptidi del veleno utilizzando un algoritmo di campionamento casuale ripetuto Monte Carlo per selezionare i codoni in modo probabilistico dalle tabelle di ricerca della frequenza dei codoni. L’uso del codone dei 72 geni ideati (3 varianti di 24 geni) è presentato nel file aggiuntivo 5: Tabella S5 e riflette l’uso del codone dei geni di Escherichia coli espressi a livelli moderati o alti. Tuttavia, le varianti del gene create incorporano cambiamenti nelle sequenze primarie del DNA che riflettono il campionamento casuale della selezione dei codoni e la libertà complessiva consentita dall’algoritmo utilizzato per la progettazione del gene. Così, l’identità media di sequenza del DNA a coppie era del 79,8% all’interno delle tre varianti dei 24 set di dati.

I 72 geni sono stati sintetizzati e clonati utilizzando il sistema Gateway nel vettore di espressione procariotica pETG82A sotto il controllo di un promotore T7 e in fusione con il gene che codifica il tag di fusione DsbC per l’espressione citoplasmatica. E. coli BL21 (DE3) pLys S sono stati trasformati con i 72 plasmidi e coltivati in mezzi di autoinduzione. Le proteine di fusione sono state purificate e l’integrità della proteina e la resa misurata mediante analisi Caliper Labchip GXII (Fig. 1a). A seconda del peptide di interesse, le frazioni purificate sono state eseguite sul Caliper Labchip GXII principalmente come una singola banda (peptidi 1, 2, 3, 4…) o come una doppia banda (5, 8, 16, 18…). La banda singola rappresenta la popolazione di proteine buone (His-DsbC-peptide) mentre la banda inferiore (circa 29 kDa) corrisponde alla sola proteina His-DsbC dopo il troncamento/degradazione del peptide target. Questa banda inferiore probabilmente indica che c’è una porzione della popolazione del peptide che non è stato piegato correttamente ed è stato degradato durante l’espressione o processi di purificazione. La concentrazione proteica raffigurata in Fig. 1b è stata calcolata integrando solo la banda His-DsbC-peptide utilizzando il software Caliper. I dati, presentati in Fig. 1b, hanno rivelato che le rese della proteina di fusione purificata variavano da ∼1 mg/L (per la proteina di fusione 14) a oltre 100 mg/L (per le proteine di fusione 4, 5, 8, 9, 10, 18 e 24). Per la stragrande maggioranza dei target (19/24) le quantità di proteina di fusione purificata permetterebbero la purificazione di milligrammi di peptide target per litro di coltura (assumendo una resa di scissione e purificazione intorno al 100%) mentre per i restanti cinque peptidi (6, 7, 11, 13 e 14) sarebbe necessario un volume di coltura maggiore.

È stata analizzata la correlazione tra la sequenza primaria delle varianti geniche e le proprietà che sono state suggerite per influenzare l’espressione. Motivi deleteri, come le strutture secondarie 5′ dell’mRNA non avrebbero potuto influenzare i livelli di espressione poiché i geni del veleno erano tutti fusi alla stessa sequenza primaria 5′, che codifica il tag di fusione delle proteine. Non c’era alcuna correlazione tra l’espressione della proteina e il numero di ponti disolfuro, la dimensione del peptide, il valore CAI e il contenuto GC (dati non mostrati). Questo suggerisce che le differenze nell’espressione genica sono state determinate da altre proprietà legate alla sequenza, in particolare dall’uso del codone. Al fine di indagare come i cambiamenti nell’uso del codone hanno influenzato i livelli di peptidi ricombinanti, la relazione tra le rese proteiche delle varianti a bassa, media e alta espressione all’interno dei 24 set di dati sono stati confrontati. Le proteine di fusione che esprimono a livelli inferiori, che riguardano i peptidi 6, 7, 11, 13 e 14 (Fig. 1), sono state escluse dall’analisi. I dati hanno rivelato che le rese proteiche delle varianti ad alta, media e bassa espressione dei peptidi analizzati erano significativamente diverse. Così, gli esprimenti inferiori hanno prodotto in media 65,1 mg/L di proteina di fusione ricombinante, mentre le rese della proteina di fusione degli esprimenti superiori erano, in media, di 87,55 mg/L (Fig. 1b). Queste differenze sono significativamente diverse (p = 0,01).

Per valutare quali differenze nell’uso del codone potrebbero spiegare le differenze osservate nell’espressione della proteina, è stato confrontato l’uso del codone delle varianti a bassa e alta espressione. Le tabelle dell’uso del codone, compresi i geni che contengono il tag di fusione, sono presentate nella tabella S6. Le maggiori differenze nell’uso dei codoni riguardano in particolare un aminoacido, la cisteina, sebbene lievi cambiamenti siano stati osservati anche per altri residui, in particolare arginina, asparagina, glutammato, istidina, isoleucina, fenilalanina e serina. I dati riassuntivi sull’uso dei codoni per questi 8 aminoacidi sono mostrati nella tabella 1. Il bias di codone osservato per i geni a bassa espressione ha rivelato una preferenza per il codone Cys-TGC mentre nei geni ad alta espressione è favorito Cys-TGT. Inoltre, nei geni a bassa espressione Cys-TGC è usato 1,38 volte più frequentemente di Cys-TGT, mentre nei geni ad alta espressione Cys-TGT è usato solo 1,04 volte più spesso di Cys-TGC. Anche se altri fattori possono eventualmente operare, questa osservazione suggerisce che l’alta espressione dei geni che codificano peptidi richiede un contributo simile di entrambi i codoni Cys-TGC e Cys-TGT, suggerendo che una percentuale maggiore di un codone rispetto all’altro influenzerà l’espressione. Anche l’uso del codone della cisteina in E. coli indica un utilizzo più equilibrato dei due codoni (tabella 1). Per indagare i fattori che possono spiegare questa osservazione, la frequenza degli aminoacidi nei geni dell’E. coli e nei 24 peptidi del veleno selezionati per questo studio e le loro proteine di fusione associate sono stati confrontati. I dati, presentati in Fig. 2, hanno rivelato che la cisteina è ~12,5 e 3,5 volte più frequente nei peptidi del veleno (14,3%) e nelle proteine di fusione ricombinanti (4,1%), rispettivamente, che in E. coli (1,16%). Quindi, i dati suggeriscono che l’espressione dei peptidi del veleno ad alti livelli è favorita dalla presenza dei due codoni di cisteina a frequenza simile nei geni sintetici. Questo dovrebbe evitare l’esaurimento di un codone quando i geni sono espressi a livelli molto alti.

I livelli di espressione dei peptidi del veleno sono influenzati dal tag di fusione

Cinque nuovi vettori per l’espressione di proteine ricombinanti in E. coli sono stati costruiti inserendo diversi tag di fusione nel backbone del pHTP1. Tutti i tag di fusione devono essere inseriti al N-terminale dei peptidi ricombinanti (Fig. 3). Due dei vettori codificano partner di fusione che contengono un peptide segnale per indirizzare l’espressione del peptide del veleno nel periplasma (pHTP4, pHTP6). I restanti tag di fusione porteranno all’espressione citoplasmatica della proteina ricombinante (Fig. 3). In tutti i casi è stato introdotto un tag 6HIS per consentire la purificazione a valle delle proteine di fusione utilizzando la cromatografia di affinità al nichel immobilizzato. Un sito di scissione della proteasi TEV (tobacco etch virus) (ENLYFQ/G) è stato introdotto in tutti i geni sintetici per consentire la rimozione del partner di fusione. Oltre al solo tag di affinità 6HIS (pHTP1) i 5 nuovi vettori includono la disolfuro isomerasi DsbC o la proteina legante il maltosio (MBP). Un derivato mutante inattivo di DsbC è stato prodotto per cercare di discriminare i ruoli di DsbC nella solubilizzazione passiva (relativa alla resa della proteina di fusione) e l’attività redox (relativa alla resa del peptide target piegato correttamente). La rappresentazione schematica di tutti i vettori utilizzati in questo studio è presentata in Fig. 3.

Sedici peptidi di veleno ben caratterizzati (compresi 7 che facevano parte dell’esperimento di utilizzo del codone descritto sopra) con origini diverse e che rappresentano diverse pieghe e modelli di legame cisteina sono stati selezionati per questo studio (vedi Tabella S3). I 16 geni sintetici sono stati inseriti nei sei diversi vettori di espressione (vedi Tabella S2 e Fig. 3) generando un totale di 96 plasmidi ricombinanti. I 96 costrutti sono stati trasformati in BL21 (DE3) pLysS. I ceppi di E. coli ricombinanti sono stati coltivati in mezzi di autoinduzione per ottenere alte densità cellulari. Dopo la purificazione per affinità al nichel, l’analisi sistematica degli elettroferogrammi Labchip GXII è stata eseguita per determinare la concentrazione delle proteine purificate e confrontare il peso molecolare apparente delle proteine di fusione purificate con il loro peso molecolare teorico previsto. I dati, presentati in Fig. 4, hanno rivelato che i 16 peptidi possono effettivamente essere prodotti utilizzando un tag di fusione. A seconda del peptide e della fusione utilizzata, i livelli di proteine di fusione purificate variavano da zero (soprattutto quando i peptidi erano clonati in pHTP1) a più di 300 mg di proteina di fusione purificata per litro di coltura. Nel complesso, i peptidi più piccoli sembrano essere più facili da produrre rispetto a quelli più grandi, ma ci sono diversi contro-esempi (come T16 che è il peptide più grande dello studio). Per i peptidi 2, 4, 7, 8, 9, 14 e 15, diversi vettori sembravano essere appropriati per l’espressione della proteina di fusione, ma nella maggior parte dei casi (13 su 16) il vettore pHTP4 (DsbC) ha superato tutti gli altri vettori. Al contrario, senza eccezione, l’espressione solubile con il solo tag 6HIS era sempre molto bassa. La presenza del peptide di segnale ha portato a livelli più alti di espressione per DsbC in tutti i casi (pHTP4 contro pHTP2) raddoppiando in media la quantità di proteina di fusione espressa. Per MBP (pHTP6 contro pHTP5) la sua presenza dà una tendenza simile (10/16). Per gli altri sei peptidi, il livello citoplasmatico era simile (1, 5, 11) o addirittura significativamente migliore (2, 7, 14). Complessivamente su 16 peptidi, quando il DsbC periplasmatico non era l’opzione migliore, era la MBP citoplasmatica (per i peptidi 2 e 14) o periplasmatica (peptide 4) che erano le migliori opzioni. Infine, l’inattivazione della funzione biologica di DsbC non ha avuto alcun effetto sui livelli di espressione delle proteine di fusione dei peptidi del veleno, poiché l’espressione di pHTP2 e pHTP3 era, in generale, molto simile.

Fusione scissione, resa peptide e corretto stato di ossidazione è influenzato principalmente dal partner di fusione e la concentrazione di DTT in tampone scissione TEV

Optimali condizioni di scissione TEV per rilasciare peptidi bersaglio da tag di fusione sono influenzati da diversi parametri tra cui enzima / substrato rapporto, composizione del buffer, periodo di incubazione e temperatura. Per studiare quali condizioni porterebbe alla migliore resa di peptidi veleno piegato, otto peptidi sono stati selezionati dalla lista di 16 prodotti nel precedente esperimento (Vedi file aggiuntivo 3: Tabella S3, peptidi in corsivo, e Fig. 4, peptidi in scatole). Poiché il partner di fusione DsbC superato altri tag in termini di rendimenti proteina di fusione e applicabilità generale, questi costrutti sono stati selezionati per lo studio di ottimizzazione scissione TEV. L’unico parametro che si è rivelato critico e quindi è stato messo a punto in questo esperimento è stata la concentrazione di DTT (0, 0,1, 0,5 e 2 mM DTT) presente nel buffer di scissione. Infatti, mentre la proteasi TEV richiede condizioni di riduzione per una scissione ottimale, una concentrazione eccessiva di DTT potrebbe portare alla riduzione dei ponti intra-disolfuro dei peptidi e alla perdita di ripiegamento e di attività biologica.

Dopo un periodo di incubazione di 18 ore, un’aliquota della miscela peptide-fusione TEV è stata acidificata. Una frazione (“prima” contro “dopo” la scissione TEV) è stata caricata sul Caliper per determinare l’efficienza di scissione e un campione è stato analizzato sulla LC-MS per quantificare la tossina e confermare il suo corretto stato di ossidazione. L’efficienza di scissione, l’analisi di massa e le rese peptidiche sono riassunte nella Fig. 5. Il clivaggio si è verificato nelle 32 condizioni testate nel saggio (che vanno dal 30 al 100% di efficienza). Come previsto, la scissione non era completa in assenza di DTT e completa con la più alta concentrazione di DTT. Degli otto peptidi, sette potrebbero essere rilevati ossidati in quantità di mg per litro di coltura. Dai 32 campioni, 19 hanno dato la massa ossidata corretta sulla LC-MS con varie rese a seconda della concentrazione di DTT durante la scissione. Per i 13 campioni rimasti, nessun picco è stato rilevato sulla LC-MS. Dai sette peptidi correttamente rilevati in vari DTT concentrazione, quattro ha dato il massimo recupero in 0,1 mM DTT, mentre due bisogno di nessun DTT e uno necessario 0,5 mM DTT per il recupero ottimale (Fig. 5, in grassetto). Una concentrazione di DTT di 0,1 mM sembrava essere il miglior compromesso da mantenere per i seguenti esperimenti e la pipeline di produzione del progetto VENOMICS. Aliquote dei 7 peptidi sono stati concentrati a 2 e 4 mg / ml e sottoposti allo stesso esperimento con 0,1 mM DTT per confermare che la scissione sarebbe possibile in queste condizioni. In media, l’efficienza è scesa del 20% ma si è verificata in tutti i casi (dati non mostrati).

Dopo l’ottimizzazione delle condizioni di scissione, le 96 proteine di fusione purificate (16 in 6 vettori, vedi Fig. 4) sono state scisse in presenza di 0,1 mM DTT alla concentrazione dei pool purificati (che vanno principalmente da 0,2 a 2 mg/mL) seguendo il protocollo descritto sopra. Dopo la scissione e l’acidificazione un’aliquota dei 96 campioni è stata analizzata mediante LC-MS per confermare la corretta massa molecolare, la resa e lo stato di ossidazione del peptide ricombinante finale del veleno. Quando rilevato, i 96 peptidi ricombinanti avevano masse molecolari in accordo con le masse previste dato residui di cisteina completamente ossidati (vedi articolo di accompagnamento per maggiori dettagli sull’analisi di spettrometria di massa); le forme ridotte delle proteine non sono mai state rilevate (dati non mostrati), probabilmente a causa della precipitazione di peptidi erroneamente ossidati durante le fasi di scissione e acidificazione. La resa finale per i 96 costrutti, presentati in Fig. 6, è stata espressa come resa finale assoluta del peptide in mg/L cultura o normalizzata al 100% per ogni peptide relativo al vettore utilizzato per l’espressione. I dati (Fig. 6) hanno rivelato che tutti i 16 peptidi in studio potrebbero essere prodotti in modo ricombinante, ma a livelli diversi. Simile alla resa ottenuta per le varianti di fusione (Fig. 4), una tendenza generale suggerisce che i peptidi più corti sono più facili da produrre di quelli più lunghi. La resa finale del peptide del veleno varia notevolmente con una differenza di 50 volte tra il caso peggiore (0,3 mg/L, T10 in pHTP6) e il caso migliore (17,6 mg/L, T1 in pHTP4). Il set di dati ha anche rivelato che c’è stato un calo significativo nei rendimenti dopo la scissione del tag di fusione. Questo è probabilmente dovuto alla condizione di recupero duro dopo la scissione (acidificazione in 5% acetonitrile, 0,1% di acido formico) dove in cima alla proteasi TEV, qualsiasi peptide scisso misfolded precipita. Come previsto dalle rese di fusione, anche se il recupero è alto, i peptidi prodotti con pHTP1 hanno dato le quantità più basse di peptidi nel complesso (0,4 mg/L in media, con un massimo di 1,9 mg/L per T8). Al contrario, i peptidi prodotti con pHTP4 (DsbC) hanno raggiunto i migliori rendimenti finali del peptide per 11 di 16 peptidi, e di questi (con l’eccezione di T11) i rendimenti erano più di 2 mg/L per ogni peptide (4,6 mg/L media). Nel complesso, le fusioni DsbC (per l’espressione periplasmatica o citoplasmatica) hanno prodotto con successo 14 dei 16 peptidi del veleno. Inoltre, un peptide (T7) potrebbe essere prodotto solo nel periplasma, utilizzando il partner di fusione DsbC, dal vettore pHTP4. Per i peptidi prodotti preferenzialmente da altri vettori (T10, 12, 13, 14, 16), le rese non superano i 2 mg/L, evidenziando la robusta espressione dal vettore pHTP4. Per questi cinque peptidi, i rendimenti più alti sono stati raggiunti con l’espressione citoplasmatica e un partner di fusione DsbC in tre casi, seguita dall’espressione periplasmatica con il partner di fusione MBP in due casi. Nella maggior parte dei casi (tranne T13,T14 e T16), la fusione esportata nel periplasma (sia per DsbC che per MBP) ha superato il suo equivalente citoplasmatico, indicando che almeno una parte del folding potrebbe avvenire nel periplasma e una parte potrebbe avvenire ex vivo durante la purificazione. Una dimostrazione sorprendente che DsbC (e probabilmente MBP) agisce, in parte, come un agente passivo solubilizzante all’interno dei batteri è il fatto che mentre le rese di fusione tra il DsbC e i costrutti DsbC mutati erano molto simili per la maggior parte dei peptidi (Fig. 4), dopo la scissione e il recupero, la resa complessiva del peptide attivo è in media tre volte superiore nel caso della fusione DsbC redox-attivo che con la sua controparte DsbC mutata. Il dettaglio dei valori quantitativi è stato riassunto nel file aggiuntivo 7: Tabella S7.

Nota che a differenza dei peptidi del veleno, Kin17 non contiene residui di cisteina. Pertanto, il rendimento di successo di scissione quando un residuo di cisteina è in posizione 1 (86%) ottenuto con Kin17 deve essere confermato per i casi di peptidi con una cisteina in posizione 1 che sarebbe probabilmente coinvolto in un ponte disolfuro nella proteina nativa.