I sistemi inducibili con tetraciclina sono stati ampiamente utilizzati nel lievito per studiare il controllo della trascrizione del gene in singole cellule15,16,17,18,19,20,21,22. Per utilizzare rtTA in questo contesto, abbiamo creato due forti doxiciclina-responsive promotori con tre (PTET3) o quattro (PTET4) siti di legame rtTA e utilizzato il ottimizzato rtTA-M2 variante 7 per controllare l’espressione del lievito-enhanced green fluorescent protein (yeGFP) 23 da questi promotori (Fig. 1a). La cassetta di espressione rtTA/PTET-yeGFP è stata integrata in una singola copia nel genoma del lievito. La variante M2 è identica alla variante trovata nei sistemi di espressione Tet-ON Advanced della ClonTech.
rtTA-M2 ha un’attività significativa in assenza di induzione da doxiciclina.
(a) Schema del setup sperimentale dove rtTA-M2 è espresso dai promotori costitutivi PMYO2 o PTDH3 e yeGFP è espresso da un promotore tet-responsivo. (b) Attivazione dose-dipendente della doxiciclina di rtTA-M2 espressa da PMYO2 o PTDH3 (media +/- s.e.m di tre repliche tecniche). AutoFL è wildtype BY4742 cellule di lievito. (c) Distribuzioni di fluorescenza della singola cellula ottenuta da cellule che portano il sistema PMYO2-rtTA a diverse concentrazioni di doxiciclina. Le tonalità di grigio progressivamente più scure corrispondono rispettivamente a 0,25, 1, 5 e 100 μg/mL di doxiciclina. AutoFL sono cellule di lievito BY4742 wildtype (d) Immagini fuse di fluorescenza in campo chiaro di cellule di lievito BY4742 wildtype o di cellule non indotte che portano il sistema PMYO2-rtTA.
Il problema della trascrizione del gene bersaglio che perde è particolarmente profondo quando rtTA è espresso ad alti livelli. Questo è illustrato nella Fig. 1b che mostra le curve di risposta alla dose della doxiciclina PTET3 quando rtTA-M2 è espresso dal forte promotore PTDH3. La fluorescenza era molto alta quando le cellule sono state esposte a quantità saturanti di doxiciclina. Tuttavia, a causa della perdita di trascrizione dal promotore PTET3, la gamma dinamica del sistema era piuttosto scarsa con l’espressione massima ~17 volte maggiore alla piena induzione rispetto all’assenza di doxiciclina.
Consistente con un modello in cui il transattivatore ha un potenziale di attivazione significativo nel suo stato non indotto, l’espressione di rtTA-M2 dal promotore debole PMYO2 ha sostanzialmente ridotto la fluorescenza in assenza di doxiciclina. Anche se la piena saturazione non è stata osservata con questo sistema, la riduzione dell’espressione leaky ha portato ad un drastico miglioramento della gamma dinamica e l’induzione con doxiciclina ha portato ad un aumento di ~ 200 volte della fluorescenza. Tuttavia, nonostante questo miglioramento, sia i dati della citometria a flusso (Fig. 1c) che i dati della microscopia a fluorescenza (Fig. 1d) hanno indicato che la rtTA-M2 non indotta causa una significativa espressione del gene reporter anche quando il transattivatore è espresso da un promotore debole.
Durante il test iniziale di dodici cloni portatori del sistema PTDH3-rtTA-M2, abbiamo scoperto serendipidamente che uno di essi emetteva una fluorescenza inaspettatamente bassa in assenza di doxiciclina ma una fluorescenza quasi normale a piena induzione (Fig. 2a). Il sequenziamento successivo ha identificato una singola mutazione nucleotidica, da guanina a timina, che cambia una glicina (GGG) in una valina (GTG) al residuo 72 all’interno della proteina transattivatrice. L’analisi Western blot ha indicato che questa sostituzione non influenza l’abbondanza della proteina (Fig. 2a, inserto, vedi Fig. S1 supplementare per i dettagli) e la ricostruzione del sistema di espressione ha confermato che la singola guanina alla mutazione timina è responsabile dei cambiamenti visti nella risposta alla dose di doxiciclina (dati non mostrati).
Mutazione della glicina 72 in rtTA-M2 riduce l’attività basale a livelli non rilevabili.
(a) Attivazione dose-dipendente della doxiciclina delle varianti di rtTA-M2 espresse da PTDH3 (media +/- s.e.m di tre repliche tecniche). AutoFL sono cellule di lievito BY4742 wildtype. Nel riquadro, un western blot (ritagliato) che confronta le abbondanze proteiche di entrambi rtTA-M2 e il mutante G72V. Tutti i campioni sono stati preparati ed eseguiti in condizioni sperimentali identiche. (b) Distribuzioni di fluorescenza di cellule singole ottenute da cellule portatrici del sistema PTDH3-rtTA(G72V) a diverse concentrazioni di doxiciclina. AutoFL sono cellule di lievito BY4742 wildtype. Le tonalità di grigio progressivamente più scure corrispondono rispettivamente a 1, 2,5, 5 e 100 μg/mL di doxiciclina. (c) Immagini fuse di campo chiaro-fluorescenza di cellule non indotte che portano i sistemi PTDH3-rtTA-M2 o PTDH3-rtTA(G72V). (d) Rappresentazione cartografica del dimero TetR in cui ogni protomero è colorato diversamente (giallo e turchese). La struttura secondaria è etichettata e G72 è mostrato come una sfera.
Il sistema PTDH3-rtTA-M2(G72V) ha una notevole gamma dinamica e ha mostrato un ~ 500 volte aumento dell’intensità di fluorescenza quando le cellule sono state indotte con doxiciclina alta rispetto a nessuna induzione (Fig. 2b). Inoltre, l’emissione di fluorescenza rilevata dalla citometria a flusso è indistinguibile dalla auto-fluorescenza cellulare in assenza di doxiciclina e la variante conserva la risposta di induzione graduata del transattivatore originale. Inoltre, l’espressione del reporter dal ceppo rtTA-M2(G72V) non indotto non era rilevabile dalla microscopia a fluorescenza anche sotto le impostazioni dello strumento dove il ceppo rtTA-M2 non indotto dava un forte segnale di saturazione (Fig. 2c).
Per capire come la singola mutazione può avere un impatto così drastico sulla gamma dinamica di rtTA-M2(G72V), abbiamo studiato dove il residuo era situato nel contesto della struttura tridimensionale della proteina. La struttura di rtTA-M2 o di altre varianti di rtTA non è stata risolta. Tuttavia, con 203 dei 207 aminoacidi del dominio TetR di rtTA conservati7, la struttura ad alta risoluzione di TetR24 dà un’idea della struttura del dominio di legame al DNA di rtTA. Nella struttura di TetR, il residuo di glicina 72 mappa in un loop flessibile situato tra gli α-elici α4 e α5, una regione che collega il dominio di legame al DNA del repressore (α1-α3) e la sua regione di legame alla tetraciclina (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Questo suggerisce che la sostituzione, che introduce una catena laterale non polare, innesca cambiamenti conformazionali a lungo raggio che alla fine influenzano l’attività del transattivatore, presumibilmente irrigidendo la sua struttura terziaria.
Per esaminare questa ipotesi, abbiamo creato due varianti aggiuntive in cui il residuo glicina è stato mutato in alanina o prolina. Queste mutazioni conservano la natura non polare del residuo di valina ma introducono catene laterali di dimensioni variabili. Abbiamo previsto che la singola catena laterale metilica dell’alanina sarebbe stata meno efficace nel prevenire l’attività indotta rispetto alla grande catena laterale ciclica della prolina. Abbiamo anche creato un sistema di espressione β-estradiolo inducibile26 per ottenere il controllo diretto dell’espressione di rtTA-M2 e usato il promotore con un sito extra di legame TetR, PTET4, per migliorare la capacità di rtTA di legare il DNA. Il sistema di espressione è illustrato schematicamente in (Fig. 3a). Abbiamo confermato tramite analisi western blot che le quattro varianti di rtTA sono espresse a livelli simili all’induzione completa di β-estradiolo (Fig. 3b, vedi Fig. supplementare S2 per i dettagli) e che la fluorescenza di un ceppo privo di rtTA ha un’espressione reporter che è indistinguibile da un ceppo di lievito BY4742 wildtype, dimostrando che non c’è espressione reporter di fondo da PTET4 (Fig. supplementare S3). S3).
Le catene laterali non polari al residuo 72 sono un determinante chiave dell’attività basale.
(a) Schema della rete genica in cui le varianti rtTA-M2 sono espresse da un promotore β-estradiolo inducibile e yeGFP è espresso da un promotore tet-responsive. (b) Western blot (ritagliato) che confronta le abbondanze proteiche di tutte e quattro le varianti rtTA quando indotte da 1000 nM di β-estradiolo o nessuna induzione. Tutti i campioni sono stati preparati ed eseguiti in condizioni sperimentali identiche. (C) Merged brightfield-fluorescenza immagini di tutte e quattro le varianti rtTA indotte da 1000 nM β-estradiolo senza induzione doxiciclina. (d) L’attività basale delle varianti rtTA in funzione del loro livello di espressione β-estradiolo-dipendente (media + / – s.e.m di tre repliche tecniche). Nell’inserto, gli istogrammi di espressione del reporter per le diverse varianti rtTA. (e) Doxiciclina attivazione dose-dipendente di rtTA-M2 varianti espresse ubiquitariamente in 1000 nM β-estradiolo (media + / – s.e.m di tre repliche tecniche).
Come previsto, la variante alanina ha mostrato una maggiore espressione di perdita rispetto alla variante valina e la variante prolina aveva una fluorescenza che era indistinguibile da auto-fluorescenza cellulare come misurato dalla citometria a flusso. Questo è evidente dalle immagini di microscopia a fluorescenza ottenute con le impostazioni dello strumento in cui il ceppo che porta la variante originale M2 dà un forte segnale di fluorescenza a piena induzione di β-estradiolo (Fig. 3c) e dalle misure di fluorescenza mediante citometria a flusso al variare dell’induzione di β-estradiolo (Fig. 3d).
Remarcabilmente, le sostituzioni di aminoacidi che riducono significativamente l’espressione basale del gene reporter hanno un effetto minimo sull’attivazione trascrizionale rtTA a piena induzione di β-estradiolo e doxiciclina. Questo è illustrato nella Fig. 3E, che mostra le curve dose-risposta per le quattro varianti G72-M2 misurate quando la doxiciclina è variata a piena induzione di β-estradiolo. Tuttavia, le sostituzioni aminoacidiche impatto sensibilità doxiciclina. Nei nostri esperimenti (Fig. 3e), la variante M2 ha avuto la massima sensibilità con una mezza concentrazione massima efficace (EC50) di ~ 0,06 μg/mL mentre la variante alanina (EC50 di ~ 0,2 μg/mL), la variante valina (EC50 di ~ 1,0 μg/mL) e la variante prolina (EC50 di ~ 1.5 μg/mL) ha richiesto progressivamente più alte concentrazioni di doxiciclina per raggiungere la massima capacità di espressione.
Per contrastare l’effetto della mutazione G72 sulla sensibilità doxiciclina, abbiamo introdotto ulteriori mutazioni nel dominio TetR che sono stati recentemente dimostrato di aumentare la sensibilità alla doxiciclina10,11,27. Abbiamo esaminato in particolare l’effetto dell’introduzione delle mutazioni che aumentano la sensibilità (SE) V9I, F67S, F86Y e R171K.
La Figura 4A,B dimostra che le mutazioni SE migliorano la sensibilità alla doxiciclina delle varianti SE-G72P e SE-G72A rtTA M2. Quando le varianti rtTA sono espresse ad alti livelli dal promotore completamente attivato β-estradiolo inducibile (Fig. 3a), l’introduzione delle mutazioni SE riduce la doxiciclina EC50 da ~ 1,5 μg/mL a ~ 0,1 μg/mL per la variante G72P (Fig. 4a) e da ~ 0,2 μg/mL a ~ 0,02 μg/mL per la variante G72A (Fig. 4b). Questo effetto si è verificato senza un cambiamento apprezzabile in espressione reporter sotto induzione doxiciclina pieno e non ha compromesso la gamma dinamica della variante SE-G72P. È interessante notare, tuttavia, che le mutazioni SE hanno causato una significativa perdita di gamma dinamica per la variante SE-G72A aumentando l’espressione del gene reporter in assenza di doxiciclina.
La sensibilità alla doxiciclina delle nuove varianti rtTA può essere migliorata dall’aggiunta di mutazioni che aumentano la sensibilità.
(a,b) Attivazione dose-dipendente della doxiciclina delle varianti rtTA espresse ubiquitariamente in 1000 nM β-estradiolo (media +/- s.e.m di tre repliche tecniche). (c-f) Heatmap che mostra l’espressione del reporter (unità arbitrarie) in funzione dell’espressione del transattivatore β-estradiolo-dipendente e dell’induzione della doxiciclina.
Per esplorare ulteriormente la relazione tra il livello di espressione di rtTA, doxiciclina EC50 e attività basale, abbiamo esaminato l’effetto sull’espressione del gene reporter di variare simultaneamente l’induzione di β-estradiolo e doxiciclina. Abbiamo studiato quattro diverse varianti M2: la variante originale, la variante originale con le mutazioni SE, la variante G72P e la variante SE-G72P.
La superficie bidimensionale dose-risposta per la variante M2 originale contiene tre regioni distinte di espressione del reporter corrispondenti a bassa, intermedia e alta espressione del gene reporter. Queste regioni sono etichettate I, II e III nella Fig. 4c-f. La regione III è dove l’espressione del reporter è massima, che dipende sia dal livello di espressione di rtTA che dal livello di induzione della doxiciclina. La regione II è dove l’espressione del reporter è relativamente alta anche quando l’induzione della doxiciclina è bassa. La regione I è dove l’espressione del reporter è bassa a causa del basso β-estradiolo o della bassa induzione della doxiciclina.
Le sole mutazioni SE (Fig. 4d) aumentano drammaticamente l’espressione del reporter in parte della regione I e nell’intera regione II. Questo conferma che queste mutazioni possono aumentare la sensibilità in una gamma ristretta di livelli di espressione di rtTA, ma anche causare un aumento significativo dell’attività di rtTA nello stato non indotto. In contrasto con questo, la mutazione G72P da sola (Fig. 4e) riduce drammaticamente l’espressione del reporter in tutta la regione II e in parte della regione III. Questo conferma che il profondo effetto di questa mutazione sull’attività di rtTA nello stato non indotto è associato ad una perdita generale di sensibilità alla doxiciclina.
La figura 4f mostra l’effetto della combinazione delle mutazioni SE e G72P. Rispetto alla variante SE (Fig. 4d), l’aggiunta della mutazione G72P contrasta l’aumento dell’espressione del reporter causato dalle mutazioni SE nella regione I e riduce l’espressione del reporter a livelli non rilevabili in questa regione. Inoltre, rispetto alla variante G72P (Fig. 4e), l’aggiunta delle mutazioni SE ripristina quasi completamente la perdita di espressione del reporter nella regione III. In altre parole, la sensibilità è migliorata senza introdurre una perdita di espressione del gene bersaglio a qualsiasi livello di espressione del transattivatore.