Il clonaggio basato sulla topoisomerasi (TOPO cloning) è un metodo di clonazione del DNA che non utilizza enzimi di restrizione o ligasi, e non richiede procedure post-PCR. Sembra facile, vero? La tecnica si basa sulla capacità di base delle coppie di basi complementari adenina (A) e timina (T) di ibridarsi e formare legami idrogeno. Questo post si concentra sulla clonazione TOPO “sticky end” (chiamata anche TOPO-TA); tuttavia, la tecnica di clonazione TOPO è stata adattata anche per la clonazione blunt end.
Quindi come funziona la clonazione TOPO?
Come illustrato nella figura qui sotto, la “A” sporgente sull’inserto blu del prodotto PCR deriva dall’uso della Taq polimerasi per la fase di amplificazione, poiché la Taq polimerasi lascia una singola deossiadenosina (A) alle estremità 3′ dei prodotti PCR. La “T” complementare nella coppia proviene da un backbone linearizzato dalla topoisomerasi I. La topoisomerasi I del DNA (rappresentata come una nuvola verde) funziona sia come endonucleasi di restrizione che come ligasi, scindendo e ricongiungendo le estremità del DNA superavvolte per facilitare la replicazione.
La tecnica TOPO utilizza specificamente la topoisomerasi I isolata dal virus Vaccinia, poiché questo enzima riconosce la sequenza di DNA 5´-(C/T)CCTT-3′ e digerisce il doppio filamento di DNA in questa sequenza. L’energia di questa rottura è immagazzinata come un legame covalente tra il filamento di DNA 3′ scisso e un residuo tirosilico della topoisomerasi I (1). Se arriva un gruppo idrossile al 5′ di un altro filamento di DNA, può attaccare questo legame covalente, unendo così i due filamenti di DNA e liberando la topoisomerasi (2).
In questi giorni i kit TOPO disponibili in commercio forniscono vettori o bracci di clonazione con residui di 3´ deossitimidina (T) sporgenti che sono legati covalentemente alla topoisomerasi. I vettori in questi kit spesso hanno anche il sito della topoisomerasi inserito in una cassetta di beta-galattosidasi che permette al ricercatore di eseguire uno screening blu-bianco dopo la trasformazione – l’auto-giunzione delle estremità del vettore risulta nella produzione di colonie blu che non hanno bisogno di essere raccolte e sequenziate per potenziali cloni positivi. Una volta introdotto il tuo inserto 3′-end “A” overhang, avviene la magia del clonaggio TOPO.
Procedura di base
Ripartiamo i passi necessari per il clonaggio TOPO:
1. Crea il tuo prodotto PCR: Progetta primer standard (non c’è bisogno di aggiungere siti di restrizione unici alle estremità) e amplifica la tua sequenza di interesse con la Taq polimerasi usando il tuo protocollo PCR preferito.
2. Impostare la reazione di clonazione TOPO: Mescolare il prodotto di PCR e il vettore TOPO.
3. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente: Puoi mettere la tua reazione sul ghiaccio se hai intenzione di trasformare subito o puoi conservare la reazione a -20C durante la notte.
4. Trasforma la reazione di clonazione TOPO in cellule competenti: È possibile utilizzare il protocollo di laboratorio standard per questo, tuttavia, si dovrebbe ridurre il tempo di incubazione in ghiaccio a 5 minuti (l’incubazione di tutti i 30 minuti non migliorerà significativamente l’efficienza di trasformazione).
5. Selezionare e analizzare 10 colonie bianche o blu chiaro: Puoi confermare la presenza del tuo inserto tramite PCR, digest di restrizione, o sequenziamento.
Pro tips
- Non aggiungere 5′ fosfati ai tuoi primer PCR; hai bisogno del gruppo idrossile libero!
- Potresti voler includere un tempo di estensione extra dopo l’ultimo ciclo di PCR per assicurarti che la “A” venga aggiunta a tutti i prodotti di PCR.
- Tieni presente che la Taq polimerasi ha un tasso di errore di circa 1 su 3.500 basi. Di solito le polimerasi con funzionalità di correzione vengono usate al posto della Taq per ridurre il tasso di errore; tuttavia, le polimerasi di correzione rimuoveranno anche tutte le estremità 3′ non appaiate nel tuo prodotto PCR. Se hai bisogno di diminuire il tasso di errore, usa uno di questi metodi per assicurarti che il tuo inserto conservi l’overhang 3′ A:
- Usa una miscela di enzima proofreading e Taq, con Taq usata in un rapporto di eccesso di 10:1.
- Purifica il tuo prodotto PCR su gel e incubalo con buffer, Taq e dATPs a 72C per 10-15min.
- Quando mescoli il prodotto di PCR con il vettore TOPO, potresti voler aggiungere del sale extra alla tua reazione:
La topoisomerasi I viene rilasciata dal vettore quando il prodotto di PCR e il vettore si legano; tuttavia, può potenzialmente rilegarsi e intaccare il DNA appena legato. Il sale aiuta a prevenire che la topoisomerasi I si ricolleghi, il che si traduce in un maggior numero di molecole intatte. (Nota che la quantità di sale che aggiungi dipenderà dal fatto che tu stia pianificando di trasformare la tua reazione in E. coli chimicamente o elettro-competente – l’eccesso di sale causa archi durante l’elettroporazione che causerebbe il fallimento dell’elettroporazione).
- Quando si incuba a temperatura ambiente, non si raccomanda di superare il limite di tempo di 5 minuti (sono state riportate efficienze di trasformazione inferiori con incubazione più lunga); tuttavia, potrebbe essere necessario incubare per 20-30 minuti se il prodotto PCR è a bassa concentrazione o si sta clonando un inserto estremamente grande.
- Siccome la reazione di legatura standard è abbastanza veloce, assicurati di essere organizzato e di preparare tutto ciò di cui hai bisogno per il passo successivo prima di procedere.
- Pre-riscaldare la tua piastra contenente antibiotici prima di piastrare la tua trasformazione può permetterti di vedere colonie entro 8 ore.
1. Shuman S. “Ricombinazione mediata dalla topoisomerasi I del DNA del virus della vaccinia in Escherichia coli è specifica della sequenza”. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Nuovo approccio al clonaggio molecolare e sintesi polinucleotidica utilizzando vaccinia DNA topoisomerasi. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Risorse aggiuntive sul Blog Addgene
- Performare la mutagenesi diretta al sito tramite PCR
- Utilizzare la mutatgenesi REPLACR per generare facilmente inserzioni e delezioni in un plasmide
- Imparare a verificare il tuo plasmide