トポイソメラーゼを用いたクローニング（TOPOクローニング）は、制限酵素やリガーゼを用いず、PCR後の処置も不要なDNAクローニング法である。 簡単そうでしょう？ この方法は、アデニン（A）とチミン（T）が相補的な塩基対を形成し、水素結合を形成する基本的な能力を利用している。 この記事では、「スティッキーエンド」TOPO（TOPO-TAとも呼ばれる）クローニングに焦点を当てていますが、TOPOクローニング技術はブラントエンドクローニングにも適用されています。
下の図に示すように、青いPCR産物のインサート上の「A」のオーバーハングは、TaqポリメラーゼがPCR産物の3’末端に単一のデオキシアデノシン（A）を残すので、増幅ステップにTaqポリメラーゼを使用したことに由来する。 このペアの相補的な “T “はトポイソメラーゼIで線形化されたバックボーンに由来するものである。 DNAトポイソメラーゼI（緑色の雲として描かれている）は、制限酵素として、またスーパーコイルDNA末端を切断・再結合するリガーゼとして機能し、複製を促進する。
TOPO技術は、ワクチンウイルス単体のトポイソメラーゼIを用いて、DNA配列 5´-(C/T)CCTT-3′ を認識して、この配列で二本鎖DNAを消化していることが特徴である。 この切断によるエネルギーは、切断された3′DNA鎖とトポイソメラーゼIのチロシル残基との間の共有結合として蓄積される(1)。 もし、別のDNA鎖から5位の水酸基が現れると、この共有結合を攻撃して2本のDNA鎖を結合させ、トポイソメラーゼを遊離させることができる（2）。
最近市販されているTOPOキットは、トポイソメラーゼと共有結合している3´デオキシチミジン（T）残基を張り出したベクターやクローニングアームを提供しています。 これらのキットのベクターは、しばしばトポイソメラーゼ部位がβ-ガラクトシダーゼカセットに挿入されており、研究者は形質転換後に青白スクリーニングを行うことができる。ベクター末端の自己接合は、青いコロニーの生成をもたらし、陽性クローンの可能性について摘出し配列決定する必要はない。
基本的な手順
TOPOクローニングに必要なステップを説明します：
1. PCR産物を作成する。 標準的なプライマーを設計し（末端に独自の制限サイトを追加する必要はありません）、お好きなPCRプロトコルを使用して、Taqポリメラーゼで目的の配列を増幅します。
2.TOPOクローニング反応をセットアップする。 PCR産物とTOPOベクターを混ぜ合わせる。
3.室温で5分間インキュベートする。
4.TOPOクローニング反応物をコンピテントセルにトランスフォームする。 しかし、氷上でのインキュベーション時間を5分に短縮すべきである（30分フルにインキュベートしても、形質転換効率は著しく改善されない）。
5. 白または水色のコロニーを10個選び、分析する。
プロからのアドバイス
- PCRプライマーに5’リン酸塩を加えないでください; 遊離水酸基が必要です!
- すべてのPCR産物に “A “が追加されることを確認するために、PCRの最後のサイクルの後に追加の延長時間を含めるとよいでしょう。
- Taqポリメラーゼが約3,500塩基に1つのエラー率であることを心に留めておいてください。 通常、エラー率を下げるためにTaqの代わりにプルーフリーディング機能を持つポリメラーゼを使用するが、プルーフリーディング機能を持つポリメラーゼは、PCR産物中の対になっていない3’末端もすべて除去してしまう。
- プルーフリーディング酵素とTaqの混合物を使用し、Taqは10:1の過剰比で使用する
- ゲル精製し、バッファ、TaqおよびdATPsとともに72℃で10-15分間インキュベートする
。
- PCR産物とTOPOベクターを混合するとき、反応に塩を追加するとよいでしょう：
Topoisomerase IはPCR産物とベクターをライゲートしたときベクターから放出されます；しかしそれは新たにライゲートしたDNAと再結合しニックする可能性があります。 塩には、トポイソメラーゼIの再結合を防ぐ効果があり、その結果、より無傷の分子を得ることができる。 (
- 室温でインキュベートする場合、5分の制限時間を超えることはお勧めしません（より長いインキュベーションによる形質転換効率の低下が報告されています）が、PCR産物の濃度が低い場合や非常に大きな挿入物をクローニングする場合は、20～30分のインキュベーションが必要になる場合があります。
- 標準的なライゲーション反応はかなり速いので、次のステップに進む前に、整理して必要なものをすべて準備しておくようにします
- 変換をプレーティングする前に、抗生物質を含むプレートをあらかじめ温めておくと、8時間以内にコロニーが見られることがあります
1. Shuman S. “Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase I in Escherichia coli is sequence specific.”（大腸菌におけるワクシニアウイルスDNAトポイソメラーゼIによる組み換えは配列特異的である。 Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796.
2.ワクシニアDNAトポイソメラーゼを用いた分子クローニングとポリヌクレオチド合成への新たなアプローチ。 Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
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