テトラサイクリン誘導性システムは、単一細胞の遺伝子転写制御の研究に酵母で広範囲に使用されている15,16,17,18,19,20,21,22。 この文脈でrtTAを使用するために、我々は3つ（PTET3）または4つ（PTET4）のrtTA結合部位を持つ2つの強いドキシサイクリン応答性プロモーターを作成し、最適化したrtTA-M2変種7を使用してこれらのプロモーターから酵母強化型グリーン蛍光タンパク質（yeGFP）23の発現を制御した（図1a）。 rtTA/PTET-yeGFP発現カセットは、酵母ゲノムに1コピーで組み込まれた。 M2バリアントは、ClonTechのTet-ON Advanced発現システムで見られるバリアントと同一である。
rtTA-M2 はドキシサイクリン誘導がない場合でも有意に活性である。
（a）rtTA-M2がPMYO2またはPTDH3構成的プロモーターから発現し、yeGFPがtet応答性プロモーターから発現する実験セットアップの概略図である。 (b) PMYO2またはPTDH3のいずれかから発現したrtTA-M2のドキシサイクリン用量依存的活性化（3テクニカルレプリケートの平均+/- s.e.m.）。 AutoFLは野生型BY4742酵母細胞。 (c) 異なるドキシサイクリン濃度でPMYO2-rtTAシステムを搭載した細胞から得られた単細胞蛍光の分布。 徐々に暗くなるグレーの色調は、それぞれ0.25、1、5、100μg/mLのドキシサイクリンに対応する。 AutoFLは野生型BY4742酵母細胞（d）野生型BY4742酵母細胞またはPMYO2-rtTAシステムを有する未誘導細胞のマージされた明視野-蛍光画像
標的遺伝子転写の漏れの問題は、rtTAが高レベルで発現したときに特に深刻である。 これは、rtTA-M2が強力なPTDH3プロモーターから発現される場合のPTET3ドキシサイクリン用量反応曲線を示す図1bに示されている。 蛍光は、細胞が飽和量のドキシサイクリンに曝露されたとき、非常に高かった。
トランスアクチベーターが非誘導状態において有意な活性化能を有するというモデルと一致して、弱いPMYO2プロモーターからのrtTA-M2の発現は、ドキシサイクリンの非存在下で蛍光を大幅に減少させた。 このシステムでは完全な飽和は観察されなかったが、リーク発現の減少によりダイナミックレンジが劇的に改善され、ドキシサイクリンによる誘導では蛍光が約200倍増加した。 しかし、この改善にもかかわらず、フローサイトメトリーデータ（図1c）と蛍光顕微鏡データ（図1d）の両方から、トランスアクティベーターが弱いプロモーターから発現した場合でも、未誘導のrtTA-M2が著しいレポーター遺伝子の発現を引き起こすことが示された。
PTDH3-rtTA-M2システムを持つ12個のクローンの最初のテスト中に、そのうちの1個がドキシサイクリン非存在下では予想外に低い蛍光を発するが、完全誘導時にはほぼ通常の蛍光を発することをセレンディピッドに発見した(Fig. 2a) 。 その後のシークエンスで、トランスアクチベータータンパク質の72番目の残基がグリシン（GGG）からバリン（GTG）に変わる1塩基変異（グアニンからチミン）が同定された。 ウェスタンブロット分析により、この置換はタンパク質量に影響を与えないことが示され（図2a、挿入図、詳細は補足図S1参照）、発現系を再構築することにより、グアニンからチミンへの単一変異がドキシサイクリン用量反応に見られる変化の原因であることが確認できた（データは示されていない）。
rtTA-M2 のグリシン 72 の変異により、基礎活性が検出不可能なレベルまで減弱される。
（a）PTDH3から発現したrtTA-M2バリアントのドキシサイクリン用量依存的活性化（3技術複製の平均+/- s.e.m. ）。 AutoFLは野生型BY4742酵母細胞である。 挿入図は、rtTA-M2とG72V変異体のタンパク質量を比較したウェスタンブロット（切り出し）である。 すべてのサンプルは、同一の実験条件下で調製・実行された。 (b）異なるドキシサイクリン濃度においてPTDH3-rtTA（G72V）系を有する細胞から得られた単一細胞蛍光の分布である。 AutoFLは野生型BY4742酵母細胞。 徐々に暗くなるグレーの色調は、それぞれ1、2.5、5、100μg/mLのドキシサイクリンに対応する。 (c）PTDH3-rtTA-M2またはPTDH3-rtTA（G72V）系を有する非誘導細胞のマージされた明視野-蛍光画像である。 (d)各プロトマーを異なる色（黄色と青緑色）に着色したTetR二量体の漫画表現。 二次構造はラベル付けされ、G72は球として示されている。
PTDH3-rtTA-M2（G72V）システムは驚くべき動的範囲を有し、細胞を高ドキシサイクリンで誘導すると誘導しない場合に比べて約500倍の蛍光強度増加を示した（図2b）。 さらに、フローサイトメトリーで検出される蛍光発光は、ドキシサイクリン非存在下での細胞内自発蛍光と区別がつかず、この変種はオリジナルのトランスアクティベーターの段階的誘導反応を保持している。 さらに、誘導されていないrtTA-M2(G72V)株からのレポーター発現は、誘導されていないrtTA-M2株が強い飽和シグナルを与える装置設定下でも蛍光顕微鏡で検出できなかった(図2c)。
たった一つの変異がrtTA-M2(G72V)のダイナミックレンジに対してこのように大幅な影響を及ぼすことができる理由を知るために、その残留物がタンパク質の三次元構造と関連してどこに位置しているかを調査した。 rtTA-M2や他のrtTA変異体の構造は未解明である。 しかし、rtTAのTetRドメインの207個のアミノ酸のうち203個が保存されており7、TetR24の高分解能構造は、rtTAのDNA結合ドメインの構造についての洞察を与えてくれるものであった。 TetRの構造では、グリシン残基72はα-ヘリックスα4とα5の間にある柔軟なループにマップされ、リプレッサーDNA結合ドメイン（α1-α3）とそのテトラサイクリン結合領域（α5-α9）をつなぐ領域となっている24,25（図2d）。
この仮説を検証するため、グリシン残基をアラニンまたはプロリンに変異させた変異体をさらに2種類作成した。 これらの変異は、バリン残基の無極性はそのままに、様々なサイズの側鎖を導入した。 私たちは、アラニンの単一のメチル側鎖は、プロリンの大きな環状側鎖よりも、未誘発活性を防ぐのに有効でないだろうと予想した。 また、rtTA-M2の発現を直接制御するためにβ-エストラジオール誘導性発現系26を作り、TetR結合部位を追加したプロモーターPTET4を用いて、rtTAのDNA結合能力を向上させた。 この発現系を（図3a）に模式的に示す。 ウェスタンブロット解析により、β-エストラジオール完全誘導時に4種のrtTA変異体が同レベルで発現することを確認し（図3b、詳細は補足図S2参照）、rtTA欠損株の蛍光は野生型BY4742酵母株と区別がつかないほどのレポーター発現があり、PTET4によるバックグラウンドレポーター発現がないことが示された（補足図S1）。
72残基にある非極性の側鎖は基礎活性の鍵となる決定要素である．
（a）rtTA-M2バリアントがβ-エストラジオール誘導性プロモーターから発現し、yeGFPがtet応答性プロモーターから発現する遺伝子ネットワークの模式図である。 (b) 1000nMのβ-エストラジオールで誘導した場合と誘導しなかった場合の4つのrtTAバリアントすべてのタンパク質量を比較したウェスタンブロット（切り出し）。 すべてのサンプルは、同一の実験条件下で調製され、実行された。 (c）1000nMのβ-エストラジオールによって誘導された、ドキシサイクリン誘導なしの4つのrtTAバリアントすべてのマージされた明視野-蛍光像である。 (d）β-エストラジオール依存性発現レベルの関数としてのrtTAバリアントの基底活性（3つの技術的複製の平均＋／-s.e.m）。 挿入図では、異なるrtTAバリアントに対するレポーター発現のヒストグラム。 (e)1000nMのβ-エストラジオールでユビキタスに発現したrtTA-M2変異体のドキシサイクリン用量依存的な活性化（3つの技術的複製の平均+/- s.e.m.).
予想通り、アラニン変種はバリン変種より高いリーキー発現を示し、プロリン変種はフローサイトメトリで測定した細胞自己蛍光と区別がつかない蛍光を有していた。 これは、元のM2変種を保有する株が完全なβ-エストラジオール誘導で強い蛍光シグナルを与える装置設定で得られた蛍光顕微鏡画像（図3c）および可変β-エストラジオール誘導でのフローサイトメトリによる蛍光測定（図3d）から明らかである。
驚くべきことに、基底レポーター遺伝子発現を著しく減少するアミノ酸置換は完全β-エストラジオールとドキシサイクリン誘導でのrtTA転写活性化にはほとんど影響を有さない。 これは、β-エストラジオール完全誘導時にドキシサイクリンを変化させたときに測定された4つのG72-M2変異体の用量反応曲線を表示した図3Eに示されている。 しかし、アミノ酸の置換はドキシサイクリン感受性に影響を与える。 我々の実験（図3e）では、M2バリアントは半値最大有効濃度（EC50）が〜0.06μg/mLで最高の感度を示したが、アラニンバリアント（EC50が〜0.2μg/mL）、バリンバリアント（EC50が〜1.0μg/mL）およびプロリンバリアント（EC50が〜1.5μg/mL）は、M2が最も高かった。
ドキシサイクリン感受性に対するG72変異の効果に対抗するために、我々は、ドキシサイクリンに対する感受性を高めることが最近示されたTetRドメインにさらなる変異を導入した10,11,27。
図4A,Bは、SE変異がSE-G72PおよびSE-G72A rtTA M2変異体のドキシサイクリン感受性を向上させることを示すものである。 rtTA変種が完全に活性化されたβ-エストラジオール誘導性プロモーターから高レベルで発現される場合（図3a）、SE変異の導入は、ドキシサイクリンEC50をG72P変種について〜1.5μg/mLから〜0.1μg/mLに低減し（図4a）、G72A変種については、〜0.2μg/mLから〜0.02μg/mLに低減した（図4b）。 この効果は、完全なドキシサイクリン誘導下でレポーター発現の顕著な変化なしに起こり、SE-G72Pバリアントのダイナミックレンジを損なうことはなかった。 しかし興味深いことに、SE変異はドキシサイクリン非存在下でレポーター遺伝子の発現を増加させることにより、SE-G72A変異体のダイナミックレンジを著しく低下させることになった。
新規rtTA変異体のドキシサイクリン感受性は感度増強変異の付加により改善することが可能であった。
（a、b）1000nMのβ-エストラジオールでユビキタスに発現したrtTAバリアントのドキシサイクリン用量依存的活性化（3技術反復の平均＋／-s.e.m.)。 (c-f) β-エストラジオール依存性トランスアクチベーター発現とドキシサイクリン誘導の関数としてのレポーター発現（任意単位）を表示したヒートマップである。
rtTA発現レベル、ドキシサイクリンEC50および基礎活性の関係をさらに調べるために、β-エストラジオールとドキシサイクリン誘導を同時に変化させてレポーター遺伝子発現への影響を検討した。
オリジナルのM2変異体の2次元用量反応表面には、低、中、高レポーター遺伝子発現に対応する3つの異なる領域がある。 これらの領域は、図4c-fにおいてI、IIおよびIIIとラベル付けされている。 領域IIIはレポーター発現が最大となる場所であり、これはrtTA発現レベルとドキシサイクリン誘導レベルの両方に依存する。 領域IIは、ドキシサイクリン誘導が低い場合でも、レポーターの発現が比較的高いところである。 領域Iは、β-エストラジオールが低いか、ドキシサイクリン誘導が低いためにレポーターの発現が低いところである。
SE変異単独（図4d）は、領域Iの一部と領域II全体においてレポーターの発現を劇的に増加させた。 これは、これらの変異がrtTAの発現レベルの狭い範囲において感度を高めるかもしれないが、非誘導状態におけるrtTAの活性の著しい上昇も引き起こすことを確認する。 これとは対照的に、G72P変異単独（図4e）は、領域II全体と領域IIIの一部でレポーターの発現を劇的に減少させる。 これは、非誘導状態におけるrtTA活性に対するこの変異の深い効果が、ドキシサイクリン感受性の一般的な損失と関連していることを確認する。
図4fは、SEとG72P変異の組み合わせの効果を示している。 SE変異体（図4d）と比較して、G72P変異を加えることは、領域IにおけるSE変異によって引き起こされるレポーター発現の増加を打ち消し、この領域においてレポーター発現を検出不可能なレベルまで減少させる。 さらに、G72P変異体（図4e）と比較して、SE変異を加えることで、領域IIIにおけるレポーター発現の損失がほぼ完全に回復する。 つまり、どのトランスアクチベーター発現レベルにおいても、リーキーな標的遺伝子発現を導入することなく、感度が向上しているのである。