Characterization of anti-inflammatory Lactobacillus reuteri BM36301 and its probiotic benefits on aged mice

Characterization of probiotic lactic acid bacteria

我々は長年、ヒト、動物、植物や食品など様々なソースから乳酸菌（LAB）を単離しています。 これらのBenebios Microorganisms（BM）コレクションは500株以上で構成され、初期スクリーニングからプロバイオティクスの可能性が明らかにされている。 今回、我々は糞便サンプル由来のヒト常在菌4株を選び、さらに詳細な検討を行った（表1）。 具体的には、Lactobacillus reuteri 2株（BM36301、BM36304）、L. gasseri 1株（BM33601）、Bifidobacterium animalis subsp.lactis 1株（BM10307）を検討した。

我々は細菌について、プロバイオティクスとしての一般的資格に関して調査しました（Table 1）。 まず、これらのBM株は酸（pH2.5）および胆汁酸（0.3 %）に対して耐性を示し、37℃で1時間の処理後に43 %～98.5 %の生存率範囲を示し、これは合理的に高いスコアであった。 次に、腸内細菌に対する抗菌活性を試験した。 L. gasseri BM33601は、試験菌株であるE. coliに対して最小限の阻害を示したが、他の菌株はすべて明確な阻害帯（LAB端から0.5-3 mmの距離）を形成した。 これらの阻害効果は、通常、LAB由来のバクテリオシン、有機酸（乳酸または酢酸）、過酸化水素、またはエタノールによるものである . 最後に、in vitroでヒト腸管上皮細胞（IECs）への結合能を調べた。 この目的のために、ヒト大腸がん細胞HT-29をカバースリップ上で15日間培養し、その上に生きたLAB培養物を1時間塗布した（Methods）。 洗浄後、残った菌体をグラム染色で可視化し、顕微鏡下で計数した。 L. reuteri BM36301株およびBM36304株は高い保持スコア（HT-29あたり5.5～7.4個）を示し、L. gasseri BM33601株は中程度（HT-29あたり1.7個）、B. animalis subsp. lactis BM10307は低い（HT-29あたり0.3個）スコアであった。 LABのIECへの強い接着は、LABが宿主に利益をもたらすために腸粘膜層に十分長くとどまる必要があるため、特に重要である 。

乳酸菌によるTNF-α産生の制御 in vitro

我々は、乳酸菌が腸の炎症を抑制する可能性についてスクリーニングすることを目指した。 そこで、ヒト骨髄系細胞（THP-1）が細菌のリポポリサッカライド（LPS）によりToll様受容体（TLR）を活性化し、TNF-αを分泌する組織培養系をin vitroで使用した。 まず、1ml培養で5×104個のTHP-1細胞を150ng/mlのLPSで3.5時間処理すると、通常200-300pg/mlのTNF-αが生成されることを確認した（図1a、レーン1および2）。 次に、24時間培養した細菌培養物の上清を回収し、真空乾燥させ、調整培地（CM）を再構成した（Methods）。 このCMは、LABや培養条件によって、TNF-αを抑制したり、誘導したりする複合的な活性を含んでいる。 実際、LPSを添加しないBM36304とBM36301のCMでもTNF-αがわずかに産生されていたが、その量はLPSによる誘導の20 %以下であった（データ未掲載）。 最後に、LPS存在下でTHP-1培養液（v/v）の5 %まで各CMを添加した（図1a、レーン3-6）。 LPSによるTNF-α産生（208±49 pg/ml、レーン2）は、L. reuteri BM36301のCMでは40 %（90.90 ± 49.3 pg/ml、レーン3）、B. animalis subsp. lactis BM10307のCMでは52 %（118.8 ± 19.0 pg/ml、レーン6）まで抑制されていることが確認された。 今回のスクリーニングでは、LPS処理によりTNF-αの発現が50 %以下に近く抑制されることを抗炎症とみなした。 しかし、L. reuteri BM36304とL. gasseri BM33601のCMは、そこまでTNF-αの産生を抑制することができなかった。 これらのCMを様々な培養条件で調製し、この不活性活性を検証した（データは示さず）。

Immunomodulation by lactic acid bacteria in vitro.a LPS-induced TNF-α production in THP-1に対する抗炎症活性について条件培地（CM）の乳酸菌（LAB）のスクリーニングを実施した。 LPS無添加では、非検出量のTNF-αが観察された（レーン1）。 150ng/mlのLPS処理で、THP-1細胞は有意な量のTNF-αを産生した（レーン2）。 各CMをTHP-1培養量の5 %に処理し、抑制効果を評価した（レーン3：L. reuteri BM36301、レーン4：L. reuteri BM36304、レーン5：L. gasseri BM3601、レーン6：B. animalis subsp. lactis BM10307）。 対照培地（MRS）のCMを調製し、レーン1および2に添加した。 *は、コントロール（レーン2）とBM36301 CM処理（レーン3）またはBM10307 CM処理（レーン6）のいずれかの間のt検定からのp < 0.03を示している。 棒グラフは、5つの独立したアッセイからの標準偏差（SD）を伴う平均を示す。 b THP-1細胞におけるTNF-α産生を誘導する炎症促進活性について、生細胞を用いたLABのスクリーニングを行う。 指数関数的に増殖する培養物から得た約1.5×108個の細菌細胞を6×105個のTHP-1細胞に6時間適用した。無細胞上清を回収し、ELISA法により分泌TNF-αを評価した。 c 各種乳酸菌によるin vitro免疫調節のまとめ

次に、グラム陽性菌の細胞成分が炎症反応を誘導する可能性があるので、菌体自体のTNF-α誘導能について検討した． そのため、細菌を指数関数的に増殖させ（16時間）、この生きた細菌細胞を採取、洗浄し、THP-1培養液に過剰（細胞数250倍）に添加した。 THP-1培地中に添加した抗生物質により、細菌細胞の代謝活性を最小に保った。 6時間培養後、分泌されたTNF-αを定量的に測定した（Fig.1b）。 4つのLAB細胞のすべてがTNF-αを誘導することがわかったにもかかわらず、BM36301は他の細胞よりも有意に少量（609 pg/ml）しか分泌しなかった。 BM36304（2342pg/ml）、BM33601（3100pg/ml）、およびBM10307（7141pg/ml）よりも有意に少量（609pg/ml）であった。 この6時間の共培養の間、THP-1細胞は、使用したLABに依存して様々な細胞死を経験することが観察された（追加ファイル1）。 最も注目すべきは、最も低いTNF-α誘導物質であるBM36301が最も少ないTHP-1死（9.7 %）を引き起こし、他の高いTNF-α誘導菌株が著しく顕著な死（24-38 %）を引き起こしたことである。 したがって、BM36301が低いTNF-αを誘導したのは、それ自体がTHP-1の生存率を低下させたためではないことがわかった。

以上のことから，in vitroでの免疫調節活性は，抑制性CM（BM36301，BM10307）では抗炎症性，誘導性生細胞（BM36304，BM33601，BM10307）では炎症性であると割り切った． BM10307は両方の活性を示したため、二重機能性を有するとした（Fig.1c）。 このように、2つのL. reuteri株が異なる活性を示すことは興味深いことである。 BM10307が両方の活性を示したことから、BM10307は二重機能性を持つと判断した。

CM中の抑制性分子は熱やトリプシンに対して安定

LABのCMは細胞成分だけでなく様々な細菌の代謝物から構成されているため、CMの抗炎症性をより理解しようと努めた。 L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) と B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b) からのCMの濃度を上げるとTNF-αの発現が定量的に減少することが確認された。 興味深いことに、より少量のBM36301由来のCM（0.5×投入または2.5 % v/v）は、実際にTNF-αをさらに誘導し、このCMがTNF-α誘導物質をある程度含むという観察と一致した（図2a、2レーンおよび3レーン）。 このことは、抗炎症物質が量的に相加的であり、THP-1細胞表面の受容体が、CM処理の増加に容易に反応するほど豊富であることを示唆している。

Suppressive CMは定量的で熱や酵素による消化に強い。 L. reuteri BM36301株のCMはLPS処理したTHP-1細胞からのTNF-α産生を定量的に抑制することが判明した。 LPSを添加した（レーン2〜6）または無添加（レーン1）のTHP-1培養物から産生されるTNF-αレベルをELISA法により測定した。 CMの処理は、LPS刺激時にTHP-1培養液量（v/v）に対して2.5 %（0.5×、レーン3）、5 %（1×、レーン4）、10 %（2×、レーン5）、15 %（3×、レーン6）添加した。 レーン1、2にはコントロール培地（MRS）のCMを5 %添加した。 b B. animalis subsp. lactis BM10307株のCMは、LPS処理したTHP-1細胞からのTNF-α産生を定量的に抑制する代謝物を含んでいる。 LPSとCMは表示通りに処理した。 対照培地（BL）のCMは、レーン1および2において5 %になるように添加した。 c BM36301（灰色）またはBM10307（黒）のCMを煮沸（レーン4）またはトリプシン処理（レーン5）し、ネイティブCM（レーン3）と活性を比較した。 結果は3つの独立した実験からのSD付き平均値である

さらに、CM中の抗炎症物質の物理化学的特性を検討した。 各株のCMを10分間煮沸しても、ネイティブCMと比較してTNF-α抑制機能の変化には効果がないことがわかった（図2c、レーン3、4）。 同様に、トリプシン処理もその活性に影響を与えなかった（Fig. 2c、レーン5）。

プロバイオティクス細菌によるマウスでのTNF-αの制御

LABスクリーニングに基づくin vitroでのTNF-α制御に関する究極の疑問は、それがin vivoでの応用とどれだけ関連するかということであった。 我々は、選択したL. reuteri株をマウスモデル系に適用することで、この疑問に直接答えようとした。 20週齢の近交系C57BL/6マウスを1群あたり雄6匹、雌8匹で準備した。 そして20週間にわたり、1群には抗炎症剤BM36301を、もう1群には炎症促進剤BM36304を、対照群にはブドウ糖を投与した（Methods）。 動物の苦痛を最小限にする手段として、LAB培養物は、マウス1匹あたり1×106個の1日消費量を満たすように飲料水を介して投与された。 また、期間中は老化が自然に進むように、標準的な食事を与えた。 20週間の培養終了時（合計40週齢）にマウスを安楽死させ、採血して血清調製を行い、定量ELISA法によりサイトカインとテストステロンを測定した。 剖検の結果、肉眼的な形態学的異常は認められなかった。

C57BL/6 マウスにプロバイオティクス細菌を補充したときのTNF-α a L. reuteri株を与えたオスマウス（n＝6ずつ）の血清中のTNF-α。 ** b L. reuteri株を摂取させた雌性マウス（n = 8匹ずつ）の血清のTNF-α。 *は対照群（レーン1、2）と比較したt検定によるp＝0.017を示す

以上のことから、抗炎症剤BM36301により血清TNF-αの減少が見られ、雌でより顕著に効果が観察されました。 炎症促進剤であるBM36304は、男性でTNF-αの増加をもたらしたが、女性では起こらなかった。

L. reuteri BM36301は、雄マウスの体重増加の抑制と高いテストステロン値を維持しました

老化は、糖尿病や肥満など、ヒトにおける多くの健康問題の原因となっています。 動物モデルでは、このような老化の問題を悪化させるために、高脂肪食がしばしば採用されます。 しかし、ヒトの老化は意図的な高脂肪食によって引き起こされるものではないはずなので、それらの加速実験に関する解釈は複雑である可能性がある。 私たちは、すべてのマウスを標準的な食事で培養し、最も自然な老化のプロセスを実現しました。 生後20週齢から20週間の実験期間中に、対照群の雄は約8g（7.83±1.2g）、対照群の雌は約5g（4.8±0.94g）体重が増加しました。 驚くべきことに、抗炎症剤BM36301を与えた雄の体重増加は、対照群（5.78 ± 0.75 g、p = 0.040）よりも36 %有意に低かった（図4a、レーン1および2）。 しかし、BM36304処理雄の体重増加量（7.53 ± 0.74 g）はコントロールと有意な差はなかった（p = 0.67）。 雌グループの体重増加は、互いに統計的に異なっていなかった。

L. L. を補充した老化雄マウスは、BM36304を補充した雌グループの体重増加（7.53±0.74g）と対照グループの体重増加とで統計的に異なっていなかった。 a L.ロイテリ株を20週間摂取させたC57BL/6マウス（n=6、灰色バー、n=8、黒バー）の純重量増加。 * b 各L. reuteri株を摂取させたマウスの血清インスリン濃度を(a)と同様に測定。 ** c 各L. reuteri株を(a)と同様に摂取させた雄マウスの血清テストステロン量。 ***は対照群（レーン1、2）との比較でt検定よりp＝0.0025を示す

もう一つの有意差は、BM36304投与雄の血清インスリン値（図4b）である。 対照の雄群では3.18 ± 0.65 ng/mlのインスリンを示したのに対し、BM36304を与えた雄群では4.91 ± 0.63 ng/mlのインスリンを示した（p = 0.027）． しかし、この群からの体重増加は対照とあまり変わらないという知見と一致し（図4a）、BM36304投与雄でより顕著な腹部脂肪蓄積は観察されなかった（データは示さず）。 40週齢の時点では、インスリンスパイクによって臨床的に明らかな糖尿病を発症していない可能性があるが、さらに老化が進むと病気がより顕著になる可能性がある。 メス群間のインスリン変動は互いに有意な差はなかった。

最後に、オスのテストステロン値に注目した。 図4cに示すように、抗炎症BM36301を与えた雄は、対照群（2.20±0.38ng/ml、p＝0.0025）より有意に高いレベルの血清テストステロンを保持した。 しかし、BM36304投与群は、対照群と統計的な差はありませんでした（3.23 ± 2.10 ng/ml、p = 0.07）。 テストステロンの結果をさらに理解するために、我々は各マウスの睾丸を調べた。 BM36301を与えたオスの対の精巣の重量は0.579 ± 0.075 gで、コントロールのそれ（0.525 ± 0.05 g, p = 0.049）より10 %重かった。 BM36301群の体重増加量が少ないことを考慮すると（図4a）、この精巣の大きさの違いはより顕著であり、体重増加量に対する精巣重量の比率（TW/WG）は、コントロールのそれはBM36301群のそれの67 %に過ぎなかった。 しかし、精巣の組織の顕微鏡的な違い、例えば精細管の直径は、これら2つのグループ間で観察できなかった（コントロールの156.03 ± 6.65 μm vs. BM36301処理雄の153.95 ± 18.66 μm、p = 0.51）。 精子形成やライディッヒ細胞面積の比較など、他の研究は行っていません。

まとめると、抗炎症作用のあるBM36301は、男性が年をとっても精巣が大きく、テストステロンが多く、体重増加を低く保つのに役立ちました。 加齢男性におけるテストステロン産生の減少は、おそらく炎症性障害の結果として、精巣の年齢依存的な病変と関連していることが提案されています。 一方、炎症性サイトカインであるBM36304は、インスリンを増加させるが、男性の体重増加やテストステロンには変化がなかった。

抗炎症性 BM36301 による女性の健康な皮膚

ある種のプロバイオティクスの興味深い特徴の 1 つは、免疫制御に依存した方法で皮膚の健康を促進できることです。 BM36301 は、in vitro および in vivo で抗炎症作用も示したため、この菌株が皮膚にそのような健康上の利点をもたらすことができるかどうか、質問しました。 投与18週目に、各グループから2匹のマウスの患部を削り、1週間後に調べた。 興味深いことに、BM36301を投与した雌のマウスは、剃毛した部分の毛の再成長が、完全には回復していないものの、早くなった（Fig. 5a）。 一方、対照群またはBM36304群では、そのような急速な回復のペースは見られなかった。 また、男性の処理群では、対照群に比べて際立って速い毛髪の再成長を示すものはなく、この毛髪の成長促進は女性のみにおいて明らかである可能性が示された。 皮膚の健康状態を評価するもう一つの指標として、毛並みのツヤを調べることがあります。