Gene design, fusion technology and TEV cleavage conditions influence of the purification of oxidized disulphide-rich venom peptides in Escherichia coli

Codon usage of venom peptide-coding genes cause expression differences

異なる種の毒ペプチドをコードし、異なる数のジスルフィドブリッジを含む様々な長さの24個の遺伝子が、コドン使用法が精製タンパク質の可溶レベルに及ぼす影響を調べるために選ばれました。 これらの遺伝子は、進化的、構造的、機能的に多様な毒ペプチドをコードしている。 この実験の目的は、コドン使用法の微妙な変化が、大腸菌における組換えペプチドの発現量に影響を与えるかどうかを評価することである。 各遺伝子の3つの変異体は、まず、コドン頻度ルックアップテーブルから確率的にコドンを選択するモンテカルロ反復ランダムサンプリングアルゴリズムを用いて、毒ペプチド配列を逆翻訳することによって設計された。 72個の考案された遺伝子（24個の遺伝子の3つの変異体）のコドン使用法は、Additional file 5: Table S5に示されており、中程度から高いレベルで発現する大腸菌の遺伝子のコドン使用法を反映している。 しかし、作成された遺伝子バリアントは、コドン選択のランダムサンプリングと遺伝子設計に使用したアルゴリズムで許容される全体的な自由度を反映したDNA一次配列の変化を組み込んでいる。

72個の遺伝子を合成し、ゲートウェイシステムを使用して、T7プロモーターの制御下でpETG82A原核生物発現ベクターにクローニングし、細胞質発現のためにDsbC融合タグをコードする遺伝子と融合させた。 大腸菌BL21 (DE3) pLys Sを72プラスミドで形質転換し、自己誘導培地で培養した。 融合タンパク質を精製し、タンパク質の完全性と収量をCaliper Labchip GXII分析で測定した（図1a）。 精製された画分は、目的のペプチドに応じて、主にシングルバンド（ペプチド1、2、3、4…）またはダブルバンド（5、8、16、18…）としてキャリパーLabchip GXII上で走行しています。 シングルバンドは良好なタンパク質集団（His-DsbC-ペプチド）を表し、下部バンド（約29kDa）は標的ペプチドを切断／分解した後のHis-DsbCタンパク質のみに相当する。 この低いバンドは、おそらくペプチド集団の中に、発現や精製の過程で適切に折り畳まれずに分解された部分があることを示しているのだろう。 図1bのタンパク質濃度は、His-DsbC-ペプチドのバンドのみを積分したもので、キャリパーソフトウェアを用いて計算されている。 図1bに示されたデータから、精製された融合タンパク質の収率は、約1mg／L（融合タンパク質14について）から100mg／L以上（融合タンパク質4、5、8、9、10、18および24について）まで変化することが判明した。 残りの5つのペプチド（6、7、11、13、14）については、より大量の培養液が必要である一方、大多数の標的（19/24）については、精製した融合タンパク質の量は、培養液1リットルあたりミリグラム規模の標的ペプチドを精製できる（切断および精製収率を約100%と仮定）だろう。 1

遺伝子変異体の主配列と発現に影響を与えるとされてきた性質間の相関が解析された。 5′ mRNA二次構造などの劇症モチーフは、毒物遺伝子がすべてタンパク質融合タグをコードする同じ5′-プライム配列に融合されていたため、発現レベルに影響を与えなかった可能性があります。 タンパク質の発現とジスルフィド結合の数、ペプチドサイズ、CAI値、GC含有量との間に相関は見られなかった（データは示していない）。 このことは、遺伝子発現の違いは、他の配列関連特性、特にコドン使用量によって決定されることを示唆している。 コドン使用法の変化が組換えペプチドのレベルにどのように影響するかを調べるために、24のデータセット内の低、中、高発現バリアントのタンパク質収量間の関係を比較した。 ペプチド6、7、11、13、14（図1）に関係する低レベルで発現する融合タンパク質は、解析から除外された。 その結果、分析したペプチドの高、中、低発現バリアントのタンパク質収量は、有意に異なることが明らかになった。 したがって、低発現体は平均65.1 mg/Lの組換え融合タンパク質を生産したが、高発現体の融合タンパク質収率は平均して87.55 mg/Lであった（図1b）。 これらの差は有意に異なる（p = 0.01）。

コドン使用法のどのような違いが、観察されたタンパク質発現の差を説明できるかを評価するために、低発現変異体と高発現変異体のコドン使用法を比較した。 融合タグを含む遺伝子を含むコドン使用率の表を表S6に示す。 コドン使用法の主な違いは、特に1つのアミノ酸、システインに関係しているが、他の残基、特にアルギニン、アスパラギン、グルタミン酸、ヒスチジン、イソロイシン、フェニルアラニンおよびセリンについてもわずかな変化が観察される。 これら8つのアミノ酸のコドン使用量データを表1に示す。 低発現遺伝子で観察されたコドンの偏りは、Cys-TGCコドンを好むが、高発現遺伝子ではCys-TGTが好まれることが明らかになった。 また、低発現遺伝子ではCys-TGCがCys-TGTの1.38倍使用されているが、高発現遺伝子ではCys-TGTはCys-TGCの1.04倍しか使用されていない。 最終的には他の要因が作用していると考えられるが、この観察から、ペプチドをコードする遺伝子の高発現には、Cys-TGCとCys-TGTの両方のコドンが同程度に寄与する必要があり、一方のコドンの割合が他方に比べて高いと、発現に影響することが示唆される。 大腸菌におけるシステインコドンの使用状況も、2つのコドンがよりバランスよく利用されていることを示唆している（表1）。 この現象を説明しうる要因を調べるため、大腸菌遺伝子と、この研究のために選択した24種の毒ペプチドおよびその融合タンパク質におけるアミノ酸頻度を比較した。 その結果、システインは大腸菌の遺伝子（1.16%）よりも毒ペプチド（14.3%）および融合タンパク質（4.1%）でそれぞれ約12.5倍および3.5倍の頻度で存在することが明らかになった（Fig.2）。 したがって、合成遺伝子に2つのシステインコドンが同程度の頻度で存在することにより、毒ペプチドの高レベルでの発現が有利になることを示唆するデータであった。 このことは、遺伝子が非常に高いレベルで発現したときに、一方のコドンが枯渇することを避けることができるはずである。

毒ペプチドの発現レベルは融合タグの影響を受ける

pHTP1バックボーンに異なる融合タグを挿入して大腸菌の組み換えタンパク質発現用新規ベクターを5種類構築しました。 すべての融合タグは組換えペプチドのN末に挿入される（図3）。 ベクターのうち2つは、ペリプラズムへの毒ペプチド発現を目標とするシグナルペプチドを含む融合パートナーをコードしている（pHTP4, pHTP6）。 残りの融合タグは、細胞質への組換えタンパク質発現をもたらす（図3）。 すべての場合において、固定化ニッケルアフィニティークロマトグラフィーを用いた融合タンパク質の下流精製を可能にするために、6HISタグが導入された。 また、すべての合成遺伝子にTEV (tobacco etch virus) プロテアーゼ切断部位 (ENLYFQ/G) を導入し、融合パートナーの除去を可能にした。 6HISアフィニティータグ単独（pHTP1）に加え、5つの新規ベクターにはジスルフィドイソメラーゼDsbCやマルトース結合タンパク質（MBP）が含まれている。 DsbCの不活性変異体は、DsbCの受動的可溶化（融合タンパク質収量に関連）と酸化還元活性（正しく折り畳まれた標的ペプチドの収量に関連）の役割を識別するために作製されたものであった。 本研究で使用した全てのベクターの模式図を図3に示す。

異なる起源および異なるフォールドおよびシステイン結合パターンを表す16のよく特徴付けられた毒ペプチド（上記のコドン使用実験の一部だった7を含む）がこの研究用に選ばれた（表S3参照）。 16個の合成遺伝子を6種類の発現ベクターに挿入し（表S2および図3参照）、合計96個の組換えプラスミドを作製した。 この96個のコンストラクトをBL21（DE3）pLysSで形質転換した。 組換え大腸菌は、高い細胞密度を得るために自動誘導培地で培養した。 ニッケルアフィニティ精製後、Labchip GXII電気泳動図の系統的解析を行い、精製タンパク質の濃度を決定し、精製した融合タンパク質の見かけの分子量と期待される理論分子量とを比較した。 Fig. 4 に示すデータから、16 種類のペプチドは、融合タグを使用して実際に製造できることが明らかになった。 ペプチドと使用する融合体によって、精製された融合タンパク質のレベルは、0から（主にペプチドをpHTP1にクローニングした場合）、培養1リットルあたり300 mg以上の精製融合タンパク質のレベルまで変化することが判明した。 全体として、小さいペプチドの方が大きいペプチドよりも生産しやすいようだが、いくつかの逆の例もある（この研究で最も大きいペプチドであるT16のように）。 ペプチド2、4、7、8、9、14、15については、異なるベクターが融合タンパク質の発現に適しているようだが、ほとんどの場合（16のうち13）ベクターpHTP4（DsbC）が他のすべてのベクターより優れていた。 一方、6HISタグ単独での可溶性発現は、例外なく常に非常に低い値であった。 シグナルペプチドの存在により、DsbCの発現量はすべてのケースで高くなり（pHTP4対pHTP2）、融合タンパク質の発現量は平均で2倍となった。 MBP (pHTP6 vs pHTP5) についても、その存在は同様の傾向を示した (10/16) 。 他の6つのペプチドについては、細胞質レベルは同等であるか(1, 5, 11)、あるいは著しく優れていた(2, 7, 14)。 16のペプチドのうち全体として，ペリプラズムDsbCが最良の選択肢でない場合，細胞質（ペプチド2と14について）またはペリプラズム（ペプチド4）MBPが最良の選択肢であった。

融合切断、ペプチド収量および正しい酸化状態は、主に融合パートナーおよびTEV切断バッファーのDTT濃度に影響を受ける

融合タグから標的ペプチドを放出する最適なTEV切断条件は、酵素/基質比、バッファーの組成、培養時間および温度などのいくつかのパラメータによって影響を受けます。 どのような条件が折り畳まれた毒ペプチドの最良の収量につながるかを調べるために、8つのペプチドを、前の実験で生成された16のリストから選択した（追加ファイル3：表S3、イタリック体のペプチド、および図4、ボックス体のペプチドを参照されたい）。 DsbC融合パートナーは、融合タンパク質収量と一般的な適用性の点で他のタグより優れていたため、これらの構築物をTEV切断の最適化研究に選択した。 この実験で重要であることが判明した唯一のパラメーターは、切断バッファに含まれるDTT濃度（0、0.1、0.5、2 mM DTT）であった。 実際、TEVプロテアーゼは最適な切断のために還元条件を必要としますが、過剰な濃度のDTTはペプチドのジスルフィド結合の減少を招き、フォールディングと生物活性が失われる可能性があります。

18時間のインキュベーション期間の後、TEV-融合ペプチド混合物のアリコートを酸性にしました。 TEV切断の「前」対「後」の画分をキャリパーにロードして切断効率を測定し、サンプルをLC-MSで分析して毒素を定量し、その正しい酸化状態を確認しました。 切断効率、質量分析、およびペプチド収量をFig.5にまとめました。 アッセイでテストした 32 条件で切断が起こった (効率は 30 から 100%の範囲)。 予想通り、開裂はDTTの非存在下では完全ではなく、最高濃度のDTTで完全に行われた。 8つのペプチドのうち、7つは培養物1リットルあたりmgの量で酸化されたことが検出された。 32サンプル中、19サンプルがLC-MS上で正しい酸化質量を示し、切断時のDTT濃度によって収量は様々であった。 残りの13サンプルについては、LC-MS上でピークは検出されなかった。 様々なDTT濃度で正しく検出された7つのペプチドから、4つは0.1 mM DTTで最も高い回収率を示し、2つはDTTを必要とせず、1つは最適な回収率のために0.5 mM DTTを必要としました（図5、太字部分）。 0.1 mMのDTT濃度は、以下の実験とVENOMICSプロジェクトの生産パイプラインのために維持される最良の妥協点であると思われた。 7 種類のペプチドのアリコートを 2 mg/mL と 4 mg/mL に濃縮し、0.1 mM の DTT で同じ実験を行い、この条件で切断が可能であることを確認した。 平均して、効率は20％低下したが、すべてのケースで発生した（データは示さず）

切断条件の最適化に続き、96個の精製融合タンパク質（6ベクター16個、図参照）は 4)を、0.1mM DTTの存在下、精製プールの濃度(主に0.2〜2mg/mLの範囲)で上述のプロトコルにしたがって開裂させた。 切断と酸性化の後、96サンプルのアリコートをLC-MSで分析し、最終的な組換え毒ペプチドの正しい分子量、収量、酸化状態を確認した。 検出されたとき、96個の組換えペプチドは、完全に酸化されたシステイン残基から予想される質量と一致する分子量を有していた（質量分析に関する詳細は、添付の記事を参照）。タンパク質の還元型は、切断および酸性化ステップ中に誤って酸化されたペプチドが沈殿するためか、決して検出できなかった（データは示されていない）。 図6に示した96のコンストラクトの最終収量は、発現に使用したベクターに対する各ペプチドの絶対的なペプチド最終収量としてmg/L培養で表すか、または100％に正規化したものであった。 データ(Fig. 6)から、研究対象の16種類のペプチドはすべて組換え生産が可能であるが、そのレベルは異なることが判明した。 融合バリアントで得られた収率（図4）と同様に、一般的な傾向として、短いペプチドは長いペプチドよりも生産が容易であることが示唆された。 最終的な毒ペプチド収量は、最悪のケース（0.3 mg/L, pHTP6 の T10）と最良のケース（17.6 mg/L, pHTP4 の T1）の間で 50 倍の差があり、大きく変動していることがわかった。 また、データセットから、融合タグ切断後に収量が大きく低下することが明らかになった。 これはおそらく、切断後の過酷な回収条件（5%アセトニトリル、0.1%ギ酸での酸性化）により、TEVプロテアーゼの上に、切断されたミスフォールドペプチドが沈殿しているためであろう。 融合収率から予想されるように、たとえ回収率が高くても、pHTP1で製造したペプチドは全体として最も少ない量になった（平均0.4 mg/L、T8では最大1.9 mg/L）。 一方、pHTP4 (DsbC)で生産したペプチドは、16ペプチド中11ペプチドで最高の最終ペプチド収量に達し、これらのうち（T11を除く）収量は各ペプチドで2 mg/L以上（平均4.6 mg/L）であった。 全体として、DsbC融合物（ペリプラズム発現または細胞質発現のいずれか）は、16個の毒ペプチドのうち14個を生産することに成功した。 さらに、1つのペプチド（T7）は、DsbC融合パートナーを用いて、pHTP4ベクターからペリプラズムにおいてのみ生産できた。 他のベクターから優先的に生産されたペプチド（T10, 12, 13, 14, 16）については、収量は2 mg/Lを超えず、pHTP4ベクターからの強固な発現が強調されている。 これらの5つのペプチドでは、3つのケースで細胞質発現とDsbC融合パートナーが、2つのケースでMBP融合パートナーによるペリプラズム発現が、最も高い収率を達成した。 ほとんどの場合（T13,T14,T16を除く）、ペリプラスムにエクスポートされた融合体（DsbCまたはMBPのいずれか）は、細胞質での同等品を上回った。これは、少なくとも折り畳みの一部はペリプラスムで起こり、一部は精製中に生体外で起こり得ることを示唆している。 DsbC（とおそらくMBP）が、部分的には細菌内部の受動的可溶化剤として働くことを示す顕著な事実として、DsbCと変異DsbC構築物の融合収率はほとんどのペプチドで非常に似ていた（図4）が、切断・回収後、活性ペプチドの全体収率は、酸化還元活性DsbC融合物の場合、変異DsbC対応物よりも平均3倍高かったことがあげられる。 定量値の詳細は、Additional file 7: Table S7にまとめた。

TEV切断部位のC末（P1）残基の性質は切断効力に著しく影響しない

いくつかの毒ペプチドのN末はその受容体結合部位に寄与し得る。 そのため、ペプチドのN末端に1つ余分な残基を導入することで、生物学的活性に影響を与える可能性がある 。 TEVの認識部位は，C末端（P1′位置）にGlyまたはSer残基を必要とし，タグ除去後の標的ペプチドのN末端には，非ネイティブのSerまたはGly残基が残されることになる． 以前の研究では、プロリンを除くすべてのアミノ酸側鎖は、TEVプロテアーゼ認識部位のP1′位置に収容でき、プロセッシングの効率にほとんど影響を与えないことが示唆された。 ただし、解析は最適なTEVバッファー条件で行った。 時間効率を高めるために、毒ペプチド生産パイプラインは、最適なTEV条件へのバッファ交換のような追加ステップに対応することができない。 そこで、TEVプロテアーゼがIMAC溶出バッファー（Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazole 250 mM, DTT 0.1 mM, pH8）でどの程度作用できるかを調べたところ、TEVタンパク分解に最適でないバッファーであった。 本研究で用いたTEVSHプロテアーゼは，大腸菌で非常に大量（100 mg/L培養まで）に過剰生産・精製が容易であることから選択されたものである． しかし、このTEVプロテアーゼの組換え誘導体の切断特異性は、特にその認識部位のP1′の位置に様々なアミノ酸がある場合、まだ不明である（Dr H. Berglund, personal communication）。 そこで、このTEVSHプロテアーゼの最適でない条件下での活性と、プロテアーゼ認識部位のP1′の位置を変化させた場合の活性を調べるために、20個の試験開裂融合タンパク質配列が作られた。 各融合タンパク質は、N-末端6HISタグ、内部TEV認識配列、それぞれP1´の位置に異なるアミノ酸を含み、C-末端にホモサピエンス由来のDNA/RNA結合タンパク質Kin17の切断型と融合させたものである。 タンパク質を精製し、96の融合タグを切断するのに用いたのと同じ条件でTEVプロテアーゼ切断に供した（上記参照）。 図7に示すデータは、収集した以前のデータを確認し、プロリン（天然由来の毒ペプチドの1位にプロリンがある確率は低い）を除いて、他のすべての残基は、ある程度の切断活性を保持しながらTEVプロテアーゼ認識部位のP1´位置に収容できることを示唆するものであった。 しかし、N末端にTrp、Thr、Leu、Glu、Arg、Asp、Val、Ileを持つペプチドは、切断効率が60％以下に低下するため、考慮する必要がある。