Sistemele inductibile cu tetraciclină au fost utilizate pe scară largă în drojdie pentru a studia controlul transcripției genice în celule unice15,16,17,18,19,20,21,22. Pentru a utiliza rtTA în acest context, am creat doi promotori puternici sensibili la doxiciclină cu trei (PTET3) sau patru (PTET4) situsuri de legare rtTA și am utilizat varianta optimizată rtTA-M27 pentru a controla expresia proteinei fluorescente verzi îmbunătățite de drojdie (yeast-enhanced green fluorescent protein, yeGFP)23 din acești promotori (Fig. 1a). Caseta de expresie rtTA/PTET-yeGFP a fost integrată într-o singură copie în genomul drojdiei. Varianta M2 este identică cu varianta găsită în sistemele de expresie Tet-ON Advanced de la ClonTech.
rtTA-M2 are o activitate semnificativă în absența inducerii cu doxiciclină.
(a) Schema montajului experimental în care rtTA-M2 este exprimat de la promotorii constitutivi PMYO2 sau PTDH3 și yeGFP este exprimat de la un promotor sensibil la tet. (b) Activarea dependentă de doza de doxiciclină a rtTA-M2 exprimată fie din PMYO2, fie din PTDH3 (media +/- s.e.m. a trei repetiții tehnice). AutoFL reprezintă celule de drojdie BY4742 de tip sălbatic. (c) Distribuțiile fluorescenței monocelulare obținute din celule purtătoare ale sistemului PMYO2-rtTA la diferite concentrații de doxiciclină. Nuanțele progresiv mai întunecate de gri corespund la 0,25, 1, 5 și, respectiv, 100 μg/mL de doxiciclină. AutoFL reprezintă celule de drojdie BY4742 de tip sălbatic (d) Imagini fuzionate în câmp luminos-fluorescență ale celulelor de drojdie BY4742 de tip sălbatic sau ale celulelor neinduse purtătoare ale sistemului PMYO2-rtTA.
Problema transcrierii cu scurgeri a genelor țintă este deosebit de profundă atunci când rtTA este exprimată la niveluri ridicate. Acest lucru este ilustrat în Fig. 1b, care prezintă curbele de răspuns la doxiciclină PTET3 atunci când rtTA-M2 este exprimat de la puternicul promotor PTDH3. Fluorescența a fost foarte ridicată atunci când celulele au fost expuse la cantități saturate de doxiciclină. Cu toate acestea, din cauza transcripției cu scurgeri de la promotorul PTET3, intervalul dinamic al sistemului a fost destul de slab, expresia maximă fiind de ~17 ori mai mare la inducția completă în comparație cu absența doxiciclinei.
În concordanță cu un model în care transactivatorul are un potențial de activare semnificativ în starea sa neindusă, exprimarea rtTA-M2 de la promotorul slab PMYO2 a redus substanțial fluorescența în absența doxiciclinei. Deși nu s-a observat o saturație completă cu acest sistem, reducerea expresiei cu scurgeri a dus la o îmbunătățire drastică a intervalului dinamic, iar inducerea cu doxiciclină a dus la o creștere de ~200 de ori a fluorescenței. Cu toate acestea, în ciuda acestei îmbunătățiri, atât datele de citometrie în flux (Fig. 1c), cât și datele de microscopie cu fluorescență (Fig. 1d) au indicat faptul că rtTA-M2 neindusă determină o expresie semnificativă a genei reporter chiar și atunci când transactivatorul este exprimat de un promotor slab.
În timpul testării inițiale a douăsprezece clone purtătoare ale sistemului PTDH3-rtTA-M2, am descoperit, în mod întâmplător, că una dintre ele emitea o fluorescență neașteptat de scăzută în absența doxiciclinei, dar o fluorescență aproape normală la inducție completă (Fig. 2a). Secvențierea ulterioară a identificat o mutație de un singur nucleotid, de la guanină la timină, care schimbă o glicină (GGG) cu o valină (GTG) la reziduul 72 în cadrul proteinei transactivatoare. Analiza Western blot a indicat că această substituție nu afectează abundența proteinei (Fig. 2a, Insert, a se vedea Fig. Suplimentară S1 pentru detalii), iar reconstrucția sistemului de expresie a confirmat faptul că mutația unică de la guanină la timină este responsabilă pentru modificările observate în răspunsul la doxiciclină (datele nu sunt prezentate).
Mutația glicinei 72 în rtTA-M2 diminuează activitatea bazală la niveluri nedetectabile.
(a) Activarea dependentă de doza de doxiciclină a variantelor rtTA-M2 exprimate din PTDH3 (media +/- s.e.m. a trei repetiții tehnice). AutoFL reprezintă celule de drojdie BY4742 de tip sălbatic. În inserție, un western blot (decupat) care compară abundența proteinelor atât ale rtTA-M2, cât și ale mutantului G72V. Toate probele au fost preparate și analizate în condiții experimentale identice. (b) Distribuțiile fluorescenței monocelulare obținute din celulele purtătoare ale sistemului PTDH3-rtTA(G72V) la diferite concentrații de doxiciclină. AutoFL reprezintă celule de drojdie BY4742 de tip sălbatic. Nuanțele progresiv mai închise de gri corespund la 1, 2,5, 5 și, respectiv, 100 μg/mL de doxiciclină. (c) Imagini fuzionate în câmp luminos-fluorescență ale celulelor neinduse purtătoare ale sistemelor PTDH3-rtTA-M2 sau PTDH3-rtTA(G72V). (d) Reprezentare cartografică a dimerului TetR în care fiecare protomer este colorat diferit (galben și turcoaz). Structura secundară este etichetată, iar G72 este reprezentată ca o sferă.
Sistemul PTDH3-rtTA-M2(G72V) are o gamă dinamică remarcabilă și a prezentat o creștere de ~500 de ori a intensității fluorescenței atunci când celulele au fost induse cu doxiciclină ridicată în comparație cu absența inducerii (Fig. 2b). Mai mult, emisia de fluorescență detectată prin citometrie de flux nu se poate distinge de autofluorescența celulară în absența doxiciclinei, iar varianta păstrează răspunsul de inducție gradat al transactivatorului original. Mai mult decât atât, expresia reporterului din tulpina rtTA-M2(G72V) neindusă a fost nedetectabilă prin microscopie cu fluorescență chiar și în setările instrumentului în care tulpina rtTA-M2 neindusă a dat un semnal puternic saturat (Fig. 2c).
Pentru a înțelege cum o singură mutație poate avea un impact atât de drastic asupra domeniului dinamic al rtTA-M2(G72V), am investigat unde a fost localizată reziduul în contextul structurii tridimensionale a proteinei. Structura rtTA-M2 sau a altor variante de rtTA nu a fost rezolvată. Cu toate acestea, având în vedere că 203 din cei 207 aminoacizi din domeniul TetR al rtTA au fost păstrați7, structura de înaltă rezoluție a TetR24 oferă o perspectivă asupra structurii domeniului de legare la ADN al rtTA. În structura TetR, reziduul de glicină 72 corespunde unei bucle flexibile situate între α-helicele α4 și α5, o regiune care face legătura între domeniul de legare a ADN-ului represor (α1-α3) și regiunea sa de legare a tetraciclinei (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Acest lucru sugerează că substituția, care introduce o catenă laterală nepolară, declanșează modificări conformaționale pe distanțe lungi care, în cele din urmă, afectează activitatea transactivatorului, probabil prin rigidizarea structurii sale terțiare.
Pentru a examina această ipoteză, am creat două variante suplimentare în care reziduul glicină a fost mutat în alanină sau prolină. Aceste mutații păstrează natura nepolară a reziduului valină, dar introduc lanțuri laterale de dimensiuni diferite. Am anticipat că singura catenă laterală de metil a alaninei ar fi mai puțin eficientă în prevenirea activității neinduse decât marea catenă laterală ciclică a prolinei. Am creat, de asemenea, un sistem de expresie indus de β-estradiol26 pentru a obține controlul direct al expresiei rtTA-M2 și am utilizat promotorul cu un situs suplimentar de legare TetR, PTET4, pentru a spori capacitatea rtTA de a lega ADN. Sistemul de expresie este ilustrat schematic în (Fig. 3a). Am confirmat prin analiza western blot că cele patru variante rtTA sunt exprimate la niveluri similare la inducția completă cu β-estradiol (Fig. 3b, a se vedea Fig. Suplimentară S2 pentru detalii) și că fluorescența unei tulpini lipsite de rtTA are o expresie de reporter care nu se distinge de o tulpină de drojdie BY4742 de tip sălbatic, demonstrând că nu există o expresie de reporter de fond din PTET4 (Fig. Suplimentară S2 pentru detalii). S3).
Legătura laterală nepolară de la reziduul 72 este un determinant cheie al activității bazale.
(a) Schema rețelei de gene în care variantele rtTA-M2 sunt exprimate de un promotor inductibil la β-estradiol și yeGFP este exprimată de un promotor sensibil la tet. (b) Western blot (decupat) care compară abundențele proteice ale tuturor celor patru variante rtTA atunci când sunt induse de 1000 nM de β-estradiol sau fără inducție. Toate probele au fost preparate și analizate în condiții experimentale identice. (c) Imagini fuzionate în câmp luminos-fluorescență ale tuturor celor patru variante rtTA induse de 1000 nM de β-estradiol fără inducție cu doxiciclină. (d) Activitatea bazală a variantelor rtTA în funcție de nivelul lor de expresie dependentă de β-estradiol (media +/- s.e.m. a trei repetiții tehnice). În inserție, histograme ale expresiei reporterilor pentru diferitele variante rtTA. (e) Activarea dependentă de doza de doxiciclină a variantelor rtTA-M2 exprimate în mod omniprezent în 1000 nM β-estradiol (media +/- s.e.m. din trei replici tehnice).
Așa cum era de așteptat, varianta cu alanină a prezentat o expresie de scurgere mai mare decât varianta cu valină, iar varianta cu prolină a avut o fluorescență care nu a putut fi distinsă de autofluorescența celulară, așa cum a fost măsurată prin citometrie de flux. Acest lucru este evident din imaginile de microscopie cu fluorescență obținute cu setări ale instrumentului în care tulpina care adăpostește varianta M2 originală dă un semnal puternic de fluorescență la inducția totală de β-estradiol (Fig. 3c) și din măsurătorile de fluorescență prin citometrie de flux la inducția variabilă de β-estradiol (Fig. 3d).
În mod remarcabil, substituțiile de aminoacizi care reduc semnificativ expresia bazală a genei reporter au un efect minim asupra activării transcripționale rtTA la inducția totală de β-estradiol și doxiciclină. Acest lucru este ilustrat în Fig. 3E, care prezintă curbele doză-răspuns pentru cele patru variante G72-M2 măsurate atunci când doxiciclina este variată la inducția completă de β-estradiol. Cu toate acestea, substituțiile de aminoacizi au un impact asupra sensibilității la doxiciclină. În experimentele noastre (Fig. 3e), varianta M2 a avut cea mai mare sensibilitate, cu o concentrație eficace la jumătatea maximă (EC50) de ~0,06 μg/mL, în timp ce varianta cu alanină (EC50 de ~0,2 μg/mL), varianta cu valină (EC50 de ~1,0 μg/mL) și varianta cu prolină (EC50 de ~1.5 μg/mL) au necesitat concentrații progresiv mai mari de doxiciclină pentru a atinge capacitatea maximă de expresie.
Pentru a contracara efectul mutației G72 asupra sensibilității la doxiciclină, am introdus mutații suplimentare în domeniul TetR care s-au dovedit recent a crește sensibilitatea la doxiciclină10,11,27. Am examinat în mod specific efectul introducerii mutațiilor de creștere a sensibilității (SE) V9I, F67S, F86Y și R171K.
Figura 4A,B demonstrează că mutațiile SE îmbunătățesc sensibilitatea la doxiciclină a variantelor SE-G72P și SE-G72A rtTA M2. Atunci când variantele rtTA sunt exprimate la niveluri ridicate de la promotorul indus de β-estradiol complet activat (Fig. 3a), introducerea mutațiilor SE reduce EC50 de doxiciclină de la ~1,5 μg/mL la ~0,1 μg/mL pentru varianta G72P (Fig. 4a) și de la ~0,2 μg/mL la ~0,02 μg/mL pentru varianta G72A (Fig. 4b). Acest efect a avut loc fără o modificare apreciabilă a expresiei raportorului în condiții de inducție completă cu doxiciclină și nu a compromis intervalul dinamic al variantei SE-G72P. Cu toate acestea, este interesant faptul că mutațiile SE au cauzat o pierdere semnificativă a intervalului dinamic pentru varianta SE-G72A prin creșterea expresiei genei reporter în absența doxiciclinei.
Sensibilitatea la doxiciclină a noilor variante rtTA poate fi îmbunătățită prin adăugarea de mutații de creștere a sensibilității.
(a,b) Activarea dependentă de doza de doxiciclină a variantelor rtTA exprimate în mod ubicuu în 1000 nM β-estradiol (media +/- s.e.m. a trei replici tehnice). (c-f) Hematograme termice care afișează expresia reporterilor (unități arbitrare) în funcție de expresia transactivatorului dependent de β-estradiol și de inducerea doxiciclinei.
Pentru a explora în continuare relația dintre nivelul de expresie a rtTA, EC50 a doxiciclinei și activitatea bazală, am examinat efectul asupra expresiei genei reporter a variației simultane a inducerii β-estradiolului și a doxiciclinei. Am investigat patru variante M2 diferite; varianta originală, varianta originală cu mutațiile SE, varianta G72P și varianta SE-G72P.
Suprafața bidimensională doză-răspuns pentru varianta originală M2 conține trei regiuni distincte de expresie a genei reporter care corespund unei expresii scăzute, intermediare și ridicate a genei reporter. Aceste regiuni sunt etichetate I, II și III în Fig. 4c-f. Regiunea III este cea în care expresia reporterului este maximă, care depinde atât de nivelul de expresie al rtTA, cât și de nivelul de inducție a doxiciclinei. Regiunea II este cea în care expresia raportorului este relativ ridicată chiar și atunci când inducerea doxiciclinei este scăzută. Regiunea I este cea în care expresia reporterilor este scăzută din cauza nivelului scăzut de β-estradiol sau a inducerii scăzute a doxiciclinei.
Mutațiile SE singure (Fig. 4d) cresc dramatic expresia reporterilor în parte din regiunea I și în întreaga regiune II. Acest lucru confirmă faptul că aceste mutații pot spori sensibilitatea într-o gamă îngustă de niveluri de expresie a rtTA, dar determină, de asemenea, o creștere semnificativă a activității rtTA în stare neindusă. În contrast cu aceasta, mutația G72P singură (Fig. 4e) reduce dramatic expresia reporterului în întreaga regiune II și într-o parte a regiunii III. Acest lucru confirmă faptul că efectul profund al acestei mutații asupra activității rtTA în starea neindusă este asociat cu o pierdere generală a sensibilității la doxiciclină.
Figura 4f arată efectul combinării mutațiilor SE și G72P. Comparativ cu varianta SE (fig. 4d), adăugarea mutației G72P contracarează creșterea expresiei raportorului cauzată de mutațiile SE în regiunea I și reduce expresia raportorului la niveluri nedetectabile în această regiune. Mai mult, în comparație cu varianta G72P (Fig. 4e), adăugarea mutațiilor SE restabilește aproape complet pierderea expresiei reporterilor în regiunea III. Cu alte cuvinte, sensibilitatea este îmbunătățită fără a introduce o expresie scăpată a genei țintă la orice nivel de expresie a transactivatorului.
.