- Caracterizarea bacteriilor lactice probiotice
- Reglarea producției de TNF-α de către bacteriile lactice in vitro
- Moleculele supresoare din CM sunt stabile în fața căldurii și a tripsinei
- Reglarea TNF-α la șoareci cu bacterii probiotice
- L. reuteri BM36301 a menținut o creștere redusă a greutății corporale și un nivel ridicat de testosteron la șoarecii masculi
- Pelea sănătoasă a femelelor de la antiinflamatorul BM36301
Caracterizarea bacteriilor lactice probiotice
Am izolat bacterii lactice (LAB) de ani de zile din diverse surse, inclusiv oameni, animale, plante și produse alimentare. Aceste colecții de microorganisme Benebios Microorganisms (BM) cuprind peste 500 de tulpini, cu potențial probiotic dezvăluit din screening-ul lor inițial. În acest studiu, am ales patru tulpini comensale umane derivate din probe fecale și le-am studiat în detaliu (tabelul 1). Cele examinate în mod special au fost două tulpini Lactobacillus reuteri (BM36301 și BM36304), o tulpină L. gasseri (BM33601) și o tulpină Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).
Am examinat bacteriile în ceea ce privește calificarea lor generală ca probiotice (tabelul 1). În primul rând, aceste tulpini BM au prezentat rezistență la acizi (pH 2,5) și la sărurile biliare (0,3 %), demonstrând un interval de supraviețuire de 43 % până la 98,5 % după un tratament de 1 h la 37 °C, care sunt scoruri rezonabil de ridicate . În continuare, am testat activitățile antimicrobiene împotriva bacteriilor enterice. În timp ce L. gasseri BM33601 a prezentat o inhibiție minimă a tulpinii tester E. coli, toate celelalte au format zone inhibitoare distincte (la o distanță de 0,5-3 mm de marginile LAB). Aceste efecte inhibitorii sunt cauzate, de obicei, de bacteriocine, acizi organici (acid lactic sau acid acetic), peroxid de hidrogen sau etanol din LAB . În cele din urmă, am analizat capacitatea lor de a se lega de celulele epiteliale intestinale umane (IEC) in vitro. În acest scop, am cultivat celule canceroase de colon uman, HT-29, pe film de acoperire timp de 15 zile și am aplicat culturi vii de LAB pe acestea timp de 1 oră (Metode). După o spălare extensivă, celulele bacteriene rămase au fost vizualizate prin colorare Gram pentru a fi numărate la microscop . Tulpinile L. reuteri BM36301 și BM36304 au prezentat scoruri de retenție ridicate (5,5-7,4 bacterii pe HT-29), în timp ce L. gasseri BM33601 a avut scoruri moderate (1,7 bacterii pe HT-29) și B. animalis subsp. lactis BM10307 a avut scoruri scăzute (0,3 bacterii pe HT-29). O aderență mai puternică a LAB la IECs este deosebit de importantă, deoarece acestea trebuie să rămână în stratul de mucoasă intestinală suficient de mult timp pentru ca beneficiile să își facă efectul asupra gazdei . Din aceste experimente primare, cele două tulpini L. reuteri au dezvăluit un potențial mai mare ca probiotice de calitate.
Reglarea producției de TNF-α de către bacteriile lactice in vitro
Am urmărit să depistăm LAB pentru potențialul lor de a suprima inflamația intestinală. În acest scop, am adaptat un sistem de cultură tisulară in vitro în care celulele mieloide umane (THP-1) secretă TNF-α la activarea receptorilor lor Toll-like (TLR) de către lipopolizaharida bacteriană (LPS) . În primul rând, am verificat că celulele THP-1 de 5 × 104 în 1 ml de cultură tratate cu LPS la o doză de 150 ng/ml timp de 3,5 h au dus, de obicei, la o producție de 200-300 pg/ml TNF-α (Fig. 1a, benzile 1 și 2). În continuare, am colectat supernatantele culturilor bacteriene cultivate timp de 24 h, le-am uscat în vid și am reconstituit mediul condiționat (CM) (Metode). Acest CM conține activități complexe atât pentru a suprima cât și pentru a induce TNF-α, în funcție de LAB și de condițiile de cultură . Într-adevăr, am observat o ușoară producție de TNF-α de către CM de la BM36304 și BM36301 fără LPS, dar această cantitate a fost mai mică de 20 % din inducția stimulată de LPS (datele nu sunt prezentate). În cele din urmă, am adăugat fiecare CM până la 5 % din cultura THP-1 (v/v) în prezența LPS (Fig. 1a, benzile 3-6). Producția de TNF-α cu LPS (208 ± 49 pg/ml, banda 2) a fost suprimată până la 40 % cu CM din L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, banda 3) și până la 52 % cu CM din B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, banda 6). Pentru scopurile noastre de screening, am considerat ca fiind antiinflamatoare suprimarea expresiei TNF-α aproape sau mai puțin de 50 % de către tratamentul cu LPS. Cu toate acestea, CM din L. reuteri BM36304 și L. gasseri BM33601 nu au fost capabile să suprime producția de TNF-α până la acest punct. Am verificat această activitate inertă prin prepararea acestor CMs în diferite condiții de cultură (datele nu sunt prezentate).
Imunomodularea prin bacterii lactice in vitro. a Screening-ul bacteriilor lactice (LAB) cu mediu condiționat (CM) pentru activități antiinflamatorii împotriva producției de TNF-α induse de LPS în THP-1. Fără LPS, s-a observat o cantitate nedetectabilă de TNF-α (banda 1). Cu 150 ng/ml de tratament cu LPS, celulele THP-1 au produs cantități semnificative de TNF-α (banda 2). Fiecare CM a fost tratat la 5 % din volumul culturii THP-1 pentru a evalua efectele sale inhibitoare (banda 3, L. reuteri BM36301; banda 4, L. reuteri BM36304; banda 5, L. gasseri BM33601; și banda 6, B. animalis subsp. lactis BM10307). CM din mediul de control (MRS) a fost preparat și adăugat în benzile 1 și 2. * indică p < 0,03 din testul t între martorul (banda 2) și cel tratat cu CM BM36301 (banda 3) sau cel tratat cu CM BM10307 (banda 6). Barele arată mediile cu deviația standard (SD) din 5 teste independente. b Screeningul LAB cu celule vii pentru activități proinflamatorii pentru a induce producția de TNF-α în celulele THP-1. Aproximativ 1,5 × 108 celule bacteriene din culturi în creștere exponențială au fost aplicate la 6 × 105 celule THP-1 timp de 6 h. Supranatantele fără celule au fost colectate și evaluate pentru TNF-α secretat prin metoda ELISA. Rezultatele arată mediile cu SD din 4 experimente independente. c Rezumat al imunomodulării in vitro de către diverse bacterii lactice
În continuare, am examinat capacitatea de inducere a TNF-α a celulelor bacteriene în sine, deoarece componentele celulare ale bacteriilor Gram pozitive pot induce răspunsuri inflamatorii . În acest scop, am crescut bacteriile până la o fază exponențială (16 h), apoi am recoltat, am spălat și am adăugat aceste celule bacteriene vii în exces (număr de celule de 250 de ori mai mare) la cultura THP-1. Activitățile metabolice ale celulelor bacteriene au fost menținute la minim prin antibioticele adăugate în mediul THP-1. După 6 h de incubare, TNF-α secretat a fost măsurat cantitativ (Fig. 1b). Chiar dacă s-a constatat că toate cele patru celule LAB induc TNF-α, BM36301 a produs o cantitate semnificativ mai mică (609 pg/ml) decât celelalte: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) și BM10307 (7141 pg/ml). În timpul acestei coincubări de 6 ore, am observat că celulele THP-1 au prezentat o moarte celulară variabilă în funcție de LAB utilizat (fișier suplimentar 1). În special, BM36301, cel mai mic inductor de TNF-α, a provocat cea mai mică cantitate de moarte a THP-1 (9,7 %), în timp ce celelalte tulpini care induc TNF-α mai mare au provocat o moarte semnificativ mai importantă (24-38 %). Prin urmare, nu este cazul în care BM36301 a indus un nivel scăzut de TNF-α din cauza pierderii viabilității THP-1 în sine. Pentru scopurile noastre de screening, am considerat LAB cu o producție activă de TNF-α mai mare de 1000 pg/ml ca fiind proinflamatoare.
În rezumat, activitățile de imunomodulare in vitro au fost atribuite ca fiind antiinflamatoare cu CM supresive (BM36301 și BM10307) și proinflamatoare cu celulele vii inductoare (BM36304, BM33601 și BM10307). Deoarece BM10307 a prezentat ambele activități, i-am atribuit o dublă funcționalitate (Fig. 1c). A fost interesant de observat că cele două tulpini L. reuteri au prezentat activități distincte. Din screeningul inițial al gamei noastre largi de colecții de BM, tulpinile antiinflamatorii s-au dovedit a fi destul de rare, cu o rată de descoperire de mai puțin de 5 % (datele nu sunt prezentate). De asemenea, unele tulpini nu au prezentat niciuna dintre cele două activități, încadrându-se astfel în categoria „neutră” (date nesemnalate).
Moleculele supresoare din CM sunt stabile în fața căldurii și a tripsinei
Din moment ce CM din LAB este compus din diverși metaboliți bacterieni, precum și din componente celulare, am căutat să înțelegem mai bine natura antiinflamatoare a CM. Expresia TNF-α a scăzut cantitativ odată cu creșterea concentrațiilor de CM din L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) și B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). În mod interesant, o cantitate mai mică de CM de la BM36301 (0,5× intrare sau 2,5 % v/v) a indus de fapt TNF-α în continuare, în concordanță cu observația că acest CM conține materiale care induc TNF-α într-o anumită măsură (Fig. 2a, benzile 2 și 3). Cu toate acestea, efectele supresive au devenit dominante în fața unor cantități mai mari de CM, ceea ce sugerează că materialele antiinflamatorii sunt aditive din punct de vedere cantitativ și că receptorii corespunzători de pe suprafața celulelor THP-1 sunt suficient de abundenți pentru a răspunde cu ușurință la creșterea tratamentului cu CM. În general, aceste observații sugerează că CM conțin metaboliți activi responsabili de suprimarea TNF-α, în ciuda naturii lor complexe.
CMM-urile supresoare sunt cantitative și rezistente la căldură și digestie enzimatică. un CM din tulpina L. reuteri BM36301 reprimă producția de TNF-α din celulele THP-1 tratate cu LPS într-o manieră cantitativă. Nivelurile de TNF-α produse de culturile THP-1 cu (benzile 2 – 6) sau fără (banda 1) LPS au fost măsurate prin metoda ELISA. Pentru tratamentul CM, s-a adăugat 2,5 % (0,5×, culoarul 3), 5 % (1×, culoarul 4), 10 % (2×, culoarul 5) sau 15 % (3×, culoarul 6) din volumul culturii THP-1 (v/v) în momentul stimulării cu LPS. CM din mediul de control (MRS) a fost adăugat în proporție de 5 % în benzile 1 și 2. Datele prezintă mediile cu SD din 3 teste independente. b CM din B. animalis subsp. lactis tulpina BM10307 conține metaboliți care reprimă producția de TNF-α din celulele THP-1 tratate cu LPS într-o manieră cantitativă. LPS și CM au fost tratate conform indicațiilor. CM din mediul de control (BL) a fost adăugat la 5 % în benzile 1 și 2. Datele provin din 3 experimente independente. c CM din BM36301 (gri) sau BM10307 (negru) au fost fie fierte (banda 4), fie tratate cu tripsină (banda 5) pentru a le compara activitățile cu CM nativ (banda 3). Rezultatele sunt medii cu SD din 3 experimente independente
Am examinat în continuare caracteristicile fizico-chimice ale materialelor antiinflamatorii din CMs. S-a constatat că fierberea CM din fiecare tulpină timp de 10 min a fost ineficientă în ceea ce privește modificarea funcțiilor lor de inhibare a TNF-α în comparație cu CM nativi (Fig. 2c, benzile 3 și 4). De asemenea, tratamentul cu tripsină nu a afectat activitățile acestora (Fig. 2c, banda 5). Aceste observații sugerează că principalii factori inhibitori din aceste CM nu sunt nici proteine, nici molecule sensibile la căldură.
Reglarea TNF-α la șoareci cu bacterii probiotice
Întrebarea finală în ceea ce privește reglarea in vitro a TNF-α pe baza screening-ului nostru LAB a fost cât de relevantă ar fi aceasta cu aplicațiile in vivo. Am încercat în mod direct să răspundem la această întrebare prin aplicarea tulpinilor L. reuteri selectate la un sistem de model de șoarece. Am pregătit șoareci C57BL/6 consangvinizați, în vârstă de 20 de săptămâni, din 6 masculi și 8 femele pe grup. Apoi, pe o perioadă de 20 de săptămâni, un grup a fost tratat cu antiinflamatorul BM36301, un alt grup a fost tratat cu proinflamatorul BM36304, iar grupul de control a fost tratat cu dextroză (Metode). Ca mijloc de a minimiza suferința animalelor, culturile LAB au fost administrate prin intermediul apei de băut pentru a respecta doza zilnică de consum de 1 × 106 bacterii pe șoarece. De asemenea, am oferit o dietă standard, astfel încât procesul de îmbătrânire să fie natural în această perioadă. La sfârșitul incubării de 20 de săptămâni (vârsta totală de 40 de săptămâni), am eutanasiat șoarecii și am prelevat sânge pentru prepararea serului în vederea măsurării citokinelor și a testosteronului prin metode cantitative ELISA. La efectuarea necropsiei, nu am constatat anomalii morfologice grosiere.
TNF-α de la șoareci C57BL/6 suplimentați cu bacterii probiotice. a TNF-α din serul de la șoareci masculi (n = 6 fiecare) hrăniți fiecare cu tulpina L. reuteri. ** indică p = 0,006 în urma testului t în comparație cu grupul de control (benzile 1 și 3). b TNF-α din serul șoarecilor femele (n = 8 fiecare) hrăniți fiecare cu tulpina L. reuteri. * indică p = 0,017 din testul t în comparație cu grupul de control (benzile 1 și 2)
În rezumat, am observat o reducere a TNF-α seric cu antiinflamatorul BM36301, cu un efect mai pronunțat observat la femele. Proinflamatorul BM36304 a condus la o creștere a TNF-α la masculi, dar nu și la femele. Aceste constatări sugerează că screeningul nostru in vitro are o relevanță semnificativă cu menținerea in vivo a TNF-α în aceste studii pe șoareci.
L. reuteri BM36301 a menținut o creștere redusă a greutății corporale și un nivel ridicat de testosteron la șoarecii masculi
Îmbătrânirea este sursa multor probleme de sănătate la om, inclusiv diabetul și obezitatea. Pentru a exacerba astfel de probleme de îmbătrânire la modelul animal, sunt adesea utilizate diete bogate în grăsimi . Cu toate acestea, interpretarea asupra acestor experimente accelerate poate fi complicată, deoarece nicio îmbătrânire la om nu ar trebui să fie determinată de o dietă bogată în grăsimi în mod intenționat. Am cultivat toți șoarecii cu o dietă standard, astfel încât procesul lor de îmbătrânire să fie cât mai natural. În intervalul de timp al experimentului de 20 de săptămâni, începând cu vârsta de 20 de săptămâni, masculii din grupul de control au câștigat aproximativ 8 g în greutate (7,83 ± 1,2 g), iar femelele din grupul de control au câștigat aproximativ 5 g în greutate (4,8 ± 0,94 g). În mod remarcabil, s-a observat că sporul în greutate la masculii hrăniți cu antiinflamatorul BM36301 a fost semnificativ mai mic decât la cei din grupul de control (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) cu 36 % (Fig. 4a, benzile 1 și 2). Cu toate acestea, creșterea în greutate a masculilor tratați cu BM36304 (7,53 ± 0,74 g) nu a fost semnificativ diferită de cea a martorilor (p = 0,67). Câștigurile în greutate ale grupurilor de femele nu au fost statistic diferite între ele.
Șoareci masculi în vârstă suplimentați cu L. reuteri tulpina BM36301 mențin un indice corporal sănătos. a Creșterea netă în greutate a șoarecilor C57BL/6 (n = 6 pentru masculi, bară gri; n = 8 pentru femele, bară închisă) hrăniți cu fiecare tulpină L. reuteri pentru o perioadă de 20 de săptămâni. * indică p = 0,040 din testul t în comparație cu grupul de control (masculi benzile 1 și 2). b Concentrația de insulină serică la șoarecii hrăniți cu fiecare tulpină L. reuteri ca la (a). ** indică p = 0,027 în urma testului t în comparație cu grupul de control (masculii din benzile 1 și 3). c Cantitatea de testosteron seric la șoarecii masculi hrăniți cu fiecare tulpină L. reuteri ca la (a). *** indică p = 0,0025 din testul t în comparație cu grupul de control (benzile 1 și 2)
O altă diferență semnificativă a fost nivelul insulinei serice de la masculii tratați cu BM36304 (Fig. 4b). În timp ce grupul de control de sex masculin a prezentat 3,18 ± 0,65 ng/ml de insulină, grupul de sex masculin hrănit cu BM36304 a prezentat 4,91 ± 0,63 ng/ml de insulină (p = 0,027). Cu toate acestea, în concordanță cu constatarea că creșterea în greutate din acest grup nu a fost mult diferită de cea a grupului de control (Fig. 4a), nu am observat o acumulare de grăsime abdominală mai proeminentă la masculii tratați cu BM36304 (datele nu sunt prezentate). La vârsta de 40 săptămâni, este posibil ca vârful de insulină să nu fi cauzat diabet evident din punct de vedere clinic la șoareci, dar boala ar fi putut deveni mai pronunțată dacă șoarecii au îmbătrânit în continuare. Variația insulinei între grupurile de femele nu a fost semnificativ diferită una de cealaltă.
În cele din urmă, ne-am concentrat asupra nivelului de testosteron al masculilor. După cum se arată în Fig. 4c, masculii hrăniți cu BM36301 antiinflamator au păstrat niveluri semnificativ mai mari de testosteron seric (5,18 ± 0,87 ng/ml) decât grupul de control (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Cu toate acestea, grupul tratat cu BM36304 nu a fost diferit din punct de vedere statistic (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) de cel de control. Pentru a înțelege mai bine rezultatele privind testosteronul, am examinat testiculele fiecărui șoarece. Greutatea testiculelor împerecheate ale masculilor hrăniți cu BM36301 a fost de 0,579 ± 0,075 g, cu 10 % mai mare decât cea a celor de control (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Având în vedere creșterea mai mică în greutate în grupul BM36301 (Fig. 4a), această diferență de mărime a testiculelor este mai evidentă; raportul dintre greutatea testiculelor și creșterea greutății corporale (TW/WG) a martorului a fost de numai 67 % din cel al grupului BM36301. Cu toate acestea, nu am putut observa diferențe microscopice ale țesuturilor din testicule, cum ar fi diametrul tubulilor seminiferi între aceste două grupuri (156,03 ± 6,65 μm la controlul față de 153,95 ± 18,66 μm la masculii tratați cu BM36301, p = 0,51). Nu am efectuat alte studii, cum ar fi compararea spermatogenezei sau a zonei celulelor Leydig.
În concluzie, antiinflamatorul BM36301 i-a ajutat pe masculi să mențină o creștere mai mică în greutate cu testicule mai mari și mai mult testosteron pe măsură ce îmbătrânesc. S-a propus ca producția redusă de testosteron la bărbații în vârstă să fie legată de leziunile dependente de vârstă la nivelul testiculelor, probabil ca urmare a unei insulte inflamatorii . Între timp, BM36304 pro-inflamator a declanșat o creștere a insulinei, deși fără modificări în ceea ce privește creșterea în greutate sau testosteronul în rândul bărbaților. În mod notabil, niciuna dintre aceste tulpini bacteriene nu a avut influențe semnificative asupra acestor măsuri corporale la șoarecii femele.
Pelea sănătoasă a femelelor de la antiinflamatorul BM36301
O caracteristică interesantă a anumitor probiotice este că acestea pot promova sănătatea pielii într-o manieră dependentă de reglarea imunitară . Deoarece BM36301 a arătat, de asemenea, efecte antiinflamatorii in vitro și in vivo, ne-am pus întrebarea dacă această tulpină poate provoca astfel de beneficii pentru sănătatea pielii. La a 18-a săptămână de tratament, am ras o zonă pe 2 șoareci din fiecare grup și i-am examinat după 1 săptămână. În mod interesant, șoarecii femele hrăniți cu BM36301 au prezentat o recreștere mai rapidă a părului, deși nu o recuperare completă, în zona rasă (Fig. 5a). În schimb, grupurile de control sau BM36304 nu au prezentat un astfel de ritm rapid de recuperare. Niciunul dintre masculii tratați nu a prezentat o reluare a creșterii părului semnificativ mai rapidă decât la martor, ceea ce indică faptul că această creștere accelerată a părului poate fi evidentă doar la femele. O altă măsură pentru a evalua sănătatea pielii este examinarea strălucirii blănii. Cu toate acestea, nu am observat diferențe semnificative între fiecare grup prin măsurători senzoriale sau cu ajutorul aparaturii de măsurare a luminii, în principal din cauza stării de strălucire relativă a blănii martorilor (datele nu sunt prezentate).
Șoarecii femele în vârstă suplimentați cu tulpina L. reuteri BM36301 prezintă o piele sănătoasă. a Experiment de recreștere a părului la șoarecii C57BL/6 care au consumat apă tratată cu tulpina L. reuteri sau apă de control. O zonă de piele cu o lățime de 2 × 2 cm a fost rasă în mod clar, iar recreșterea părului a fost examinată o săptămână mai târziu. b Numărul foliculilor piloși (HF) a fost colectat din probele de secțiune a pielii șoarecilor hrăniți fie cu tulpini de control, fie cu tulpini L. reuteri. Au fost numărate cinci imagini microscopice la o rezoluție de 400× de la 5 până la 8 șoareci. * indică p = 0,023 în urma testului t în comparație cu grupul de control (femelele din benzile 1 și 2). c Secțiunile de piele de la șoarecii de control (stânga) și de la șoarecii tratați cu BM36301 (dreapta) au fost colorate cu Hematoxilină și Eozină pentru a arăta straturile de țesut cutanat și HF-urile ca fiind etichetate. Fotografiile au fost realizate la o rezoluție de 100×; bara indică o lungime de 100 μm pentru scară
Am evaluat în continuare sănătatea pielii prin examinarea secțiunilor transversale ale pielii la microscop după colorarea cu Hematoxilină și Eozină. După cum se arată în Fig. 5b și c, am constatat că șoarecii femele tratate cu BM36301 au prezentat un număr mai mare de foliculi de păr subcutanat (HF) decât șoarecii femele de control. Numărul de HF pe vedere microscopică la rezoluția 400× a fost de 3,50 ± 0,52 pentru grupul de femele de control, în timp ce numărul a fost de 4,80 ± 0,61 de la femelele hrănite cu BM36301, cu o diferență semnificativă (p = 0,023). Cu toate acestea, femelele tratate cu BM36304 au prezentat doar o ușoară schimbare (4,15 ± 1,73, p = 0,55 față de grupul de control). La o analiză mai detaliată a foliculilor de păr, am constatat că femelele hrănite cu BM36301 au prezentat etape ale ciclului de păr marginal mai active decât cele de control (anagen + catagen: telogen a fost 81: 19 de la control vs. 95: 5 de la femelele hrănite cu BM36301). Între timp, numărul de HF din grupurile de bărbați nu a fost foarte diferit unul de celălalt (Fig. 5b). În cele din urmă, am evaluat, de asemenea, grosimea pielii măsurată ca adâncime de la epidermă la panicul carnosus (Fig. 5c, fișier suplimentar 1). Nu am putut găsi o mare diferență de adâncime între femelele de control și cele tratate cu BM36301. Cu toate acestea, straturile dermice ale șoarecilor hrăniți cu BM36301 s-au dovedit marginal mai adânci decât cele ale martorilor, iar țesutul adipos de la șoarecii tratați cu BM36301 a fost mai puțin adânc decât cel al martorilor. Cele mai multe HF subcutanate au fost găsite în derm.
În ansamblu, aceste observații sugerează că tratamentul cu antiinflamatorul BM36301 a favorizat o piele mai sănătoasă, așa cum reiese din recreșterea părului și din numărul de HF la femele. Cu toate acestea, diferențele microscopice ale probelor de piele între grupul de control și cel cu BM36301 au părut mai degrabă marginale. Aceste beneficii pentru sănătatea pielii nu au fost observate la bărbați. De asemenea, BM36304 proinflamator nu a provocat niciun efect advers asupra pielii în momentul experimentelor.
.