Producția pe cale sexuală a unor organisme identice din punct de vedere genetic este cunoscută sub numele de clonare implică divizarea unui singur embrion, fie genele nucleare și numărul mic de gene mitocondriale ar fi „identice”, fie poate implica transferul nuclear, caz în care doar genele nucleare ar fi „identice”. După o luptă de mai mulți ani, în 1995, oamenii de știință au clonat doi miei „Megan și Morag” la „Roslin Institute” din Scoția, care au fost clonați din celule provenite dintr-un embrion timpuriu1 , deși amfibienii au fost deja clonați cu succes în anii 1950. Ulterior, s-a raportat că o serie de miei s-au născut prin clonare. În februarie 1997, după 277 de încercări, a fost clonat un miel numit „Dolly”, a cărui durată de viață a fost mult mai mare decât a altor miei clonați.2 Clonarea lui Dolly a anunțat începutul unei noi perioade în agricultură, cu posibilitatea protejării și multiplicării rapide a genotipurilor selectate.3 Până în prezent, multe animale au fost clonate prin transfer nuclear la mamifere precum oile, caprele, bovinele, iepurii și șoarecii.4 Clonarea are numeroase aplicații și facilitează înmulțirea rapidă a stocurilor de animale dorite, înmulțirea animalelor transgenice, modificări genetice specifice la animalele domestice și conservarea speciilor pe cale de dispariție.1 Cu toate acestea, unele probleme sunt încă nerezolvate, cum ar fi problemele etice și morale și ratele scăzute de succes în cazul transferului nuclear de celule somatice din cauza erorilor epigenetice ca urmare a unei programări nucleare inexacte,5 toți factorii au restricționat satisfacția și aplicabilitatea clonării în agricultură.
Limitarea clonării se datorează interacțiunii complexe a mai multor motive, cum ar fi bunăstarea animalelor și lipsa de încredere în sănătatea pe termen lung a animalului clonat.6 În timpul utilizării tehnicii de clonare, cea mai mare parte a embrionilor aparent de bună calitate nu reușesc să se dezvolte în timpul sarcinii sau după naștere.7 Eșecul reprogramării nucleului donat este principala cauză a eșecului, din cauza importanței sale în ceea ce privește modelul corect al expresiei genice care va avea loc în timpul embriogenezei ulterioare.8 Această reprogramare trebuie să aibă loc într-un interval de timp scurt, într-un context celular diferit în comparație cu dezvoltarea normală, și este predispusă la erori. Există din ce în ce mai multe date care documentează abaterile în reprogramarea epigenetică.9
Rata de eșec a clonării este foarte mare,10 mulți embrioni clonați se pot dezvolta până la stadiul de preimplantare, dar marea majoritate nu vor duce la o sarcină viabilă.11 În ciuda utilizării ca primitoare a femelelor sincrone sănătoase și fertile ca primitoare, s-a raportat că 50 % din pierderi au avut loc la începutul primului trimestru și aproape 80 % au pierdut sarcina până în al doilea trimestru, în principal din cauza anomaliilor placentare.12 Conform studiilor efectuate la vaci și oi, cea mai dramatică perioadă de pierdere a fătului este în momentul atașării placentei.4 După terminarea gestației, animalele clonate se confruntă cu dificultăți mai mari de adaptare la viața extrauterină,13 ele arată normal, dar sunt diferite din punct de vedere genetic, iar aceste diferențe se datorează unor anomalii epigenetice dobândite în timpul reprogramării nucleare.10 La animalele clonate se constată multe anomalii gestaționale și neonatale12 , care se pot datora exprimării neregulate și probabil reprogramării incomplete a genelor imprimate.14 Conform altor rapoarte, diferența se datorează unor anomalii ale lungimii telomerilor, expresiei genelor sau modelelor de metilare.4
O altă problemă constatată la animalele clonate este reprezentată de anomaliile placentare. Potrivit multor oameni de știință, moartea timpurie a embrionului se datorează dezvoltării slabe a placentei. La animalele clonate a fost raportată o dezvoltare anormală a membranei alontoice și o dezvoltare redusă a vaselor de sânge placentare, numărul placentei este mult mai mic la animalele clonate15 și se pare că capacitatea de schimb de gaze a placentei este semnificativ redusă, deoarece s-a constatat că fetușii clonați la sfârșitul gestației sunt hipoxici16.
Viabilitatea postnatală a urmașilor clonați este mai scăzută la animalele clonate, dar depinde de animal.17 În perioada postnatală, în cea mai mare parte, vițeii au prezentat probleme respiratorii18 probleme cardiovasculare, scheletice și ale sistemului nervos central.7 Potențialul efectelor erorilor epigenetice asupra compoziției animalelor clonate de aceea siguranța produselor alimentare derivate a avut un obstacol major în obținerea aprobării de reglementare pentru intrarea în lanțul alimentar.
Anomalii epigenetice
Epigenetica înseamnă ”studiul modificărilor ereditare mitotice și/sau meiotice ale funcției genice care nu pot fi explicate prin modificări ale secvenței ADN.19 Conform teoriei, clona și animalul donator ar trebui să aibă același genom, dar este puțin probabil ca mamiferele clonate să prezinte ocazional anomalii de dezvoltare datorate erorilor epigenetice.20 Uneori, creșterea excesivă a placentei și a fătului, denumită „sindromul urmașului mare „15 , alte anomalii, printre care se numără probleme respiratorii, anomalii cardiovasculare majore și mărirea organelor, sunt observate în mod obișnuit la rumegătoarele clonate21 , motiv pentru care aplicabilitatea clonării în agricultură este foarte limitată.22
Rezultatul practic este că există multe animale clonate care se comportă și par normale, în timp ce investigații mai amănunțite au dezvăluit că chiar și unele dintre aceste animale aparent normale sunt subtil diferite de populația produsă în mod natural.23 În cazul clonării, atunci când celula somatică este transferată de la donator la receptor, în acel moment nucleul celulei somatice trebuie reprogramat rapid pentru a-și asuma noua viață de celulă embrionară.24 În orice caz, în cazul în care celula nu este capabilă să se reprogrameze sau în cazul reprogramării complete, aceasta duce la o dezvoltare nereușită și, eventual, la anomalii neletale la clonele supraviețuitoare.4 Unele gene sunt exprimate corect în embrionii clonați, cum ar fi enzimele metabolice importante, dar expresia altor gene este în general anormală, ceea ce afectează viața viitoare a clonei. În astfel de condiții, cea mai mare parte a clonei pare să fi avut o sarcină normală și o perioadă neonatală normală, iar perspectivele unei vieți normale par bune, dar dezvoltarea placentei și mediul intrauterin pentru multe clone este suboptimal și numai acest lucru poate avea un impact asupra sănătății lor în viața ulterioară.25
Metilarea ADN-ului joacă un rol important în exprimarea genelor care controlează dezvoltarea animalelor.5 S-a raportat că erorile epigenetice afectează în primul rând modelele de metilare a ADN-ului și organizarea cromatinei la embrionul clonat.19 Frecvent, modelul celulei donatoare de metilare a ADN-ului este menținut în timpul dezvoltării preimplantare14 , ceea ce duce la reprogramarea efectului și care cauzează o placentare anormală.26 Secundar, acesta este un motiv important pentru rata scăzută a natalității.24
Anomalii placentare
Placenta este principalul organ de contact materno-fetal, joacă un rol vital în menținerea sarcinii și menține fătul prin satisfacerea partiției nutritive pozitive și a funcțiilor endocrine critice. Supraviețuirea și dezvoltarea fătului în timpul sarcinii depind de dezvoltarea morfologică și funcțională adecvată a placentei. Clonarea este întotdeauna asociată cu anomalii ale placentei, iar indicii de insuficiență placentară în cazul sarcinilor prin transfer nuclear includ anomalii precum sindromul de descendență mare, proteine modificate ale membranei placentare și fetale, greutate crescută a placentei, precum și mărirea placentomei și edemul la bovine.27 Hidroalantoza a fost clasificată de Farin ca o afecțiune de tip II a sindromului de descendență anormală în Această afecțiune placentară patologică crește fluidul fetal și creează dificultăți în localizarea fătului în interiorul cornului uterin. 27
În sarcina timpurie a animalelor clonate, rata de mortalitate fetală se apropie de aproximativ 80%26 , care se datorează în cea mai mare parte funcționării defectuoase și subdezvoltării placentei.15 În mod obișnuit, la bovine, 50-70% din sarcinile din ziua 50 sunt pierdute pe tot parcursul restului gestației și până la termen din cauza lipsei vascularizării placentare și a locurilor de atașare care sunt importante pentru schimbul de nutrienți și previn starea de hipoxie a fătului.7 În al treilea trimestru la vacile gestante cu fetuși clonați, au fost raportate, de asemenea, unele anomalii placentare, cum ar fi edemul și hidroalantoza, cu o probabilitate de apariție de aproximativ 45%.28 Hidroalantoza se observă cel mai frecvent între zilele 150 și 180 ale sarcinilor clonate.28 Conform cercetărilor, disfuncția și mărirea placentei se poate datora proteinelor placentare care au arătat o supraexprimare a TIMP-229 , dar, conform altora, se poate datora modificării expresiei genice în trofoblastul placentei clonate.30
Dificultăți în parturiție
În prezent, clonarea are, în general, o efficiență scăzută, ca urmare a unui număr destul de mare de factori, cum ar fi reprogramarea nucleului, diferențierea celulelor donatoare și situația ovocitelor.31 Perioada de reprogramare este etapa cheie pentru optimizarea clonării.32 În acest moment, dacă reprogramarea nu are loc în mod corespunzător, atunci aceasta duce la anomalii epigenetice și crește rata de mortalitate. și vițeii clonați somatic sunt aparent mai grei decât clonele embrionare33 , ceea ce reprezintă, de asemenea, un exemplu de anomalii epigenetice care cresc complicațiile la naștere.13 Fătul de dimensiuni mari, inclusiv toate anomaliile neonatale datorate unei erori epigenetice, este denumit „sindromul vițelului mare”.34 În cazul sarcinilor cu transfer nuclear, este frecventă prelungirea duratei de gestație, ceea ce se datorează eșecului placentei de a furniza cortizol fetal aproape de termen sau lipsei de eliberare de ACTH de către făt.26 Dezechilibrul hormonal și dimensiunea mare a fătului reprezintă pasul spre distocie, pe lângă problemele post-partum aferente, pot avea efecte negative grave asupra sănătății mamei, precum și asupra producției viitoare și a performanțelor reproductive ale acesteia în cadrul efectivului.7
Viabilitatea pre și postnatală
Embrionul este considerat de bună calitate dacă numărul de celule este destul de bun, deoarece este un criteriu important care verifică fezabilitatea embrionului după transferul la o mamă surogat, astfel încât numărul scăzut de celule din embrionul clonat va fi legat de un procent scăzut de supraviețuire după transferul embrionului la mai multe specii.35 Embrionii bovinelor clonate cu un procent mai mare de blastomeri apoptotici au prezentat o rată de gestație mai mică după 90 de zile de la transferul de embrioni și, ulterior, o rată mai mică de fătare.36
Viabilitatea postnatală este net inferioară pentru multe clonate.37 Proporția vițeilor clonați născuți care sunt supraviețuitori pe termen mai lung variază între 47% și 80%.38 La naștere, vițeii și mieii clonați prezintă în mod obișnuit semne ale unui mediu uterin stresant; capacitatea de rezervă placentară este cel mai probabil limitată din cauza dezvoltării inadecvate.7 Este evident că viabilitatea fetală la animalele clonate variază de la un experiment la altul și de la o specie la alta, șoarecii și caprele clonate prezentând o viabilitate postnatală mai bună care se poate datora tehnicii, tulpinii de animale sau tipului de placentă.26 La vițeii clonați, venele și arterele ombilicale lărgite sunt, de asemenea, o cauză importantă de deces în perioada postnatală din cauza septicemiei la nivelul structurilor ombilicale39 .
Potrivit noilor cercetări, problemele vasculare sunt, de asemenea, o cauză a morții postnatale, cum ar fi hipertensiunea pulmonară, leziunile, edemul și efuziile pleurale, pe lângă congestia capilară a septurilor alveolare și tromboza pulmonară care provoacă tulburări hemodinamice. Aceste alterări au inhibat probabil expansiunea alveolară completă și au explicat insuficiența pulmonară care a contribuit la rata scăzută de supraviețuire postnatală a vițeilor clonați.40 Aceste probleme de dezvoltare vasculară au rezultat ca alterări primare sau cheie datorate modificărilor epigenetice cauzate de clonare.
Deși aceste aberații epigenetice particulare pot fi minore și nu reprezintă o problemă de bunăstare pentru animal, ele pot limita unele aplicații practice ale tehnologiei, deoarece diminuează uniformitatea potențială a animalelor clonate.41 Un fenotip al clonelor bine cunoscut în diagonala speciilor este confirmarea sistemelor imunitare compromise, cu aplasie timică la bovinele clonate și o producție mai scăzută de anticorpi la șoarecii clonați.26 Sistemele imunitare compromise pot crește propensiunea acestora la infecții și boli.9
În postnatal de Probele de sânge recoltate de la mieii clonați după naștere au evidențiat o gamă largă de anomalii care indică disfuncții renale și hepatice.32 Pierderile ulterioare de-a lungul perioadei postnatale se datorează în cea mai mare parte unor anomalii ale sistemelor cardiovascular, scheletic și nervos central, infecții ombilicale și pulmonare, împreună cu tulburări digestive și renale.7 Pierderile postnatale la ovine sunt mai mari decât la bovine.26
Fenotipurile clonelor adulte
Dacă modelele de expresie a genelor sunt anormale în momentul preimplantării și în stadiile timpurii de implantare, atunci morfologia clonei va fi, de asemenea, anormală.42 În cele mai multe cazuri, clona arată normal și are o fiziologie normală, dar există totuși multe rapoarte care prezintă anomalii asociate cu fenotipul,41 cum ar fi „sindromul urmașilor mari”.9 Acesta se datorează unei erori în expresia genelor de creștere și dezvoltare fetală.43 Incidența acestor anomalii poate varia în funcție de specie, genotip, sex, tip de celulă sau aspecte specifice ale protocolului de transfer nuclear.4
Rata mare de eșec
O barieră în calea utilizării practice a tehnicilor care implică transferul nuclear de celule somatice este posibilitatea scăzută de a obține embrioni clonați; doar câteva procente din ovocitele reconstruite sunt întotdeauna capabile să se dezvolte.43 Până în prezent, rata de succes în cazul clonării intra-speciei este de 1%44 , în ciuda utilizării unui primitor sănătos și sincronizat, în plus față de calitatea bună a embrionului utilizat. La majoritatea speciilor de mamifere, evaluarea morfologiei embrionului rămâne metoda de selecție a unei varietăți de embrioni practicabili înainte de transfer. Acesta este modul cel mai realist și util din punct de vedere clinic de evaluare a viabilității embrionului.14 Dar, totuși, în majoritatea cazurilor, se raportează pierderi semnificative de sarcină în stadiile timpurii de dezvoltare, aproximativ la vârsta de 30-90 de zile de gestație45 , din cauza eșecului membranei placentare și a reducerii dezvoltării vaselor placentare39 , se raportează că ratele de sarcină la începutul primului trimestru sunt mai mici de 1/2 din cele așteptate în mod normal, pierderile embrionare sunt foarte mari și aproape 80 % dintre ele sunt avortate în al doilea trimestru, în plus, la sfârșitul gestației, există un nivel ridicat de șanse de a dezvolta anomalii placentare și fatale decât cele normale.7 Principala cauză a pierderilor din trimestrul al treilea sunt hidroalantoza și hidropsul fetal, de obicei atribuite unei placentații inadecvate.16 De asemenea, în literatura de specialitate se menționează că pierderea fătului clonat se datorează, de asemenea, stării hipoxice, deoarece la animalele clonate numărul placentei este mai mic, ceea ce permite un schimb mai mic de substanțe nutritive de la mamă la făt și creează condiții nefavorabile pentru dezvoltarea fătului.15
Rata ridicată a pierderilor de sarcină și moartea neonatală a vițeilor clonați se datorează reprogramării nucleare incomplete; mai mulți autori au confirmat în mod convingător că celula somatică donatoare este reprogramată astfel încât modelul de expresie în stadiul de blastocist este semnificativ diferit de cel al celulei somatice înainte de transferul nuclear.46 Potrivit lui Arnold et al.,47 expresia genelor critice pentru dezvoltarea normală a placentei este deformată la embrionii bovinelor clonate, iar acest lucru este probabil să cauzeze o diferențiere anormală a trofoblastului și să contribuie la pierderea sarcinii. Chiar și descendenții în curs au placente mari și greutăți crescute la naștere, cunoscute sub numele de sindromul descendenților mari14 , iar unii cu un aspect aparent sănătos suferă de disfuncții imunitare, ceea ce duce la o mortalitate crescută.24
Potrivit unui raport al lui Marfil et al.48 la vițeii clonați, detresă respiratorie 19% și în această condiție vițeii au murit fără niciun alt semn de anomalie. Un cordon ombilical mărit 37%, hiper/hipotermia 17% și decubit deprimat/prolungat 20% sunt cele mai frecvente cauze de deces între 24h și 60 de zile de la naștere. Printre problemele care pot scădea rata de supraviețuire a acestor viței la naștere sau în jurul nașterii se numără durata crescută a gestației, distocia severă, dezvoltarea și funcția insuficientă a placentei și eșecurile căilor metabolice necesare pentru viața extrauterină și unele probleme congenitale, cum ar fi hipoplazia cerebeloasă, insuficiența respiratorie și mărirea inimii.4
Este posibil să fie normal ca clonele să aibă o sensibilitate diferită la stres în comparație cu animalele conservatoare, din această cauză ele fiind mai predispuse la agenți patogeni, ceea ce poate crește, de asemenea, rata de mortalitate a clonelor.23 Pentru a prevala asupra eficienței scăzute a clonării, au fost încercate diferite metode diferite, cum ar fi utilizarea diferitelor tipuri de linii de celule donatoare, o varietate de sisteme de cultură, diferite metode de fuziune și substanțe chimice.35 Unele dintre aceste eforturi de cercetare au condus la o îmbunătățire minoră a calității embrionilor clonați, care este strâns legată de dezvoltarea embrionară și de productivitatea descendenților.
Etică
Clonarea animalelor este cheia dezvoltării în domeniul agriculturii și al medicinei, dar este acceptabilă numai atunci când obiectivele și metodele sunt justificate din punct de vedere etic și când este realizată în condiții etice. Oamenii de știință fac cercetări extinse în domeniul clonării animalelor, dar acum sunt ridicate multe probleme etice. Ineficiența remarcabilă a clonării reprezintă o amenințare serioasă la adresa bunăstării animalelor.49 Adesea, mai puțin de un procent din încercările de clonare vor avea ca rezultat o naștere reușită, iar dintre cele care se nasc, doar un procent relativ mic este suficient de sănătos pentru a trăi mai mult de câteva zile sau săptămâni.35 Conform unui sondaj, 64% dintre locuitorii din SUA sunt împotriva clonării, considerând că aceasta este împotriva bunăstării animalelor, motiv pentru care este o greșeală din punct de vedere moral.50
În timpul clonării, cel mai grav rezultat etic este durerea pe care o suferă animalele în timpul acestui proces, pe lângă aceasta, clonarea are efecte și asupra altor populații de animale. Din această cauză, ființele umane pot fi, de asemenea, grav afectate de clonarea animalelor prin compromiterea siguranței animalelor utilizate în producția de alimente.51 Clonarea afectează grav atât donatorul, cât și primitorul, deoarece în cazul clonării se efectuează mai întâi o intervenție chirurgicală pentru a extrage ovulul de la donator și apoi o nouă intervenție chirurgicală la primitor pentru a implanta ovulul cu șanse minime de a obține un rezultat, în plus, dacă animalul reușește să își încheie cu succes durata gestației, din cauza unui motiv necunoscut, greutatea mare a urmașilor17 , pentru aceasta este nevoie, de cele mai multe ori, de cezariană, ceea ce face ca animalul să sufere din nou de durere.
Sunt raportate și alte probleme în care animalul suferă de durere, ceea ce este împotriva bunăstării animalelor, cum ar fi hidroalantoza, afecțiune tipic fatală în care animalul gestant se umflă cu lichid până la punctul în care pare că este pe cale să explodeze.48 Este clar că embrionii produși prin transfer nuclear pot duce, în unele cazuri, la o dezvoltare instabilă a fătului și la o incidență crescută a distociei, a cezariilor și a morții perinatale, ceea ce poate avea efecte negative asupra primitoarei și a urmașilor, toate aceste lucruri, în mod cumulativ, ridicând dificultăți de ordin moral52 . Biodiversitatea este o plasă de siguranță care protejează împotriva răspândirii bolilor la animale, dar clonarea reprezintă efortul de a fixa un set de gene dezirabile și de a crea copii exacte ale animalului sursă, ceea ce este opus diversității și ridică, de asemenea, o serie de probleme etice.53
Siguranța alimentară
Fiecare țară are un departament special care se ocupă de produsele alimentare obținute prin biotehnologie. Cu toate acestea, produsele biotehnologiei animale trebuie să treacă prin evaluări de siguranță care se efectuează înainte de acceptarea publică și guvernamentală a utilizării lor pentru consumul uman.23 Posibila capacitate a erorilor epigenetice de a schimba compoziția alimentelor, de aceea produsele alimentare derivate din animale de fermă clonate a fost un obstacol major în obținerea aprobării de reglementare pentru intrarea produselor clonate în lanțul alimentar. În plus, un test de hrănire la șobolani a confirmat că utilizarea cărnii provenite de la animale clonate nu a avut niciun efect asupra creșterii corporale, a consumului de hrană, a stării generale, a activității locomotorii, a reflectelor, a ciclului sexual, a analizelor de urină, a hematologiei, a biochimiei sângelui sau a histologiei.23 Având în vedere că tehnologia este încă considerată nouă și necunoscută, plus lipsa oricăror produse cu beneficii directe pentru consumatorul de astăzi, nu este șocant faptul că acceptarea actuală este scăzută. Cu toate acestea, maturizarea tehnologiei și disponibilitatea unor astfel de produse, în combinație cu populațiile îmbătrânite din lumea occidentală dezvoltată, cu o dorință puternică de a rămâne sănătoși mai mult timp, ar putea în cele din urmă să crească gradul de acceptare.54