Compararea analizei cromozomiale și a analizei microarray cromozomiale: care este valoarea analizei cromozomiale în epoca actuală a matricei genomice?

Analiza cromozomială și CMA sunt instrumente de diagnosticare utile din punct de vedere clinic pentru detectarea anomaliilor cromozomiale în întregul genom uman. În prezent, CMA este recomandată ca test de prim rang pentru dizabilitatea intelectuală și defectele congenitale, înlocuind rolul anterior al analizei cromozomiale. În acest studiu, am comparat rezultatele analizei cromozomiale și ale CMA în 3.710 cazuri pentru a determina valoarea efectuării analizei cromozomiale.

Detecția maximă a mozaicismului prin combinarea CMA și a analizei citogenetice tradiționale

Acest studiu a arătat că 1,2% (43/3.710) dintre pacienți au avut o descoperire mozaică. Mozaicismul a fost observat doar prin analiza cromozomială în 39% din cazuri, din cauza unui procent foarte mic (<10%) sau foarte mare (>80%) de celule anormale, în timp ce 12% din cazuri au fost detectate doar prin CMA. Restul de 49% dintre cazuri au fost detectate atât prin CMA, cât și prin analiza cromozomială.

Detecția mozaicismului prin CMA și cea prin analiza cromozomială diferă din cauza diferenței de tehnologie și de populație celulară analizată. CMA analizează ADN-ul extras din toate celulele nucleate din sângele periferic, inclusiv din mai multe linii celulare. În schimb, analiza cromozomială se efectuează în principal pe limfocite T stimulate cu fitohemaglutinină. Studiile au demonstrat că CMA poate fi mai sensibilă atunci când celulele anormale nu răspund la mitogeni și/sau anomaliile sunt rare sau absente în celulele T, cum ar fi în cazul sindromului Pallister-Killian.5,6 Cinci cazuri de trisomie mozaică, implicând cromozomii 8, 9, 14 și 22, au fost detectate numai prin CMA.

Deși CMA poate detecta cu ușurință mozaicismul la niveluri de 30% sau mai mari, este limitată în detectarea de rutină a mozaicismului la niveluri de <10%.6,13,14 Alte platforme de matrice, cum ar fi matricele de polimorfism cu un singur nucleotid, pot fi mai bine capabile să detecteze mozaicismul prin informațiile obținute din frecvențele alelelor B.15,16 Analiza cromozomială poate detecta mozaicismul de nivel scăzut prin examinarea individuală a unui număr mare de celule. Studiile cromozomiale standard pe 20 de celule vor exclude un mozaicism de 14% la un nivel de încredere de 95%. Mai multe celule pot fi examinate atunci când sunt identificate una sau două celule anormale în metafază. Cu toate acestea, analiza multor celule individuale consumă timp și necesită multă muncă. Dacă se suspectează sau se confirmă mozaicismul, se poate utiliza FISH pentru a examina sute de celule individuale din interfază pentru a determina nivelul mozaicismului; FISH este relativ mai puțin consumatoare de timp decât analiza cromozomială.

Anomaliile ratate de CMA, excluzând rearanjamentele aparent echilibrate, reprezintă <0,2% din totalul cazurilor din acest studiu ( tabelul 2 ). Majoritatea cazurilor au fost nedetectabile prin CMA, deoarece proporția de celule anormale a fost sub limita de detecție a CMA (10%). Semnificația clinică este neclară pentru mozaicismul de nivel foarte scăzut în cazurile 2 și 3, precum și pentru cromozomul marker mic care conține exclusiv secvențe repetate pericentromerice în cazul 4. Anomaliile rămase ratate de CMA sunt asociate cu anomalii fenotipice. Nu este clar de ce anomalia observată în 30 % din celulele cultivate în cazul 5 a fost ratată de CMA, dar se presupune că aceasta se datorează faptului că celulele anormale sunt suprareprezentate în mod specific în celulele T. Prezența a două linii celulare diferite cu câștiguri și pierderi genomice care implică aceeași regiune a dus la un echilibru genomic net pentru regiunea respectivă, eludând astfel detectarea de către CMA, după cum se arată în cazul 6.

Detectarea mozaicismului prin CMA se bazează pe abaterea de la rapoartele logice așteptate pentru deleție sau duplicare fără mozaicism. Mozaicismul suspectat trebuie să fie confirmat prin analiza cromozomială pe celule cultivate sau prin analiza FISH, de preferință folosind frotiuri de sânge. În cele 11 cazuri studiate aici, CMA a fost capabilă să detecteze anomalia cromozomială, dar nu a putut să detecteze că este vorba de mozaic din cauza unui procent scăzut de celule normale sau a prezenței unui cromozom izodicentric care duce la tetrasomie segmentară. De exemplu, două cazuri au avut o creștere a numărului de copii detectată de toate sondele pentru cromozomul 18 de către CMA ( Figura 2 ), sugerând trisomia 18. În realitate, analiza cromozomială a arătat că un caz avea trisomia 18 în toate celulele ( figura 2a ), în timp ce celălalt caz avea mozaicism pentru trisomia 18 în 80 % din celule ( figura 2b ). În plus, atunci când două sau mai multe linii celulare anormale implică aceeași regiune, așa cum se exemplifică în cazul din figura 2c , analiza cromozomială și/sau analiza FISH este esențială pentru o interpretare corectă a anomaliilor cromozomiale.

Informațiile structurale cromozomiale sunt furnizate de analiza cromozomială, dar nu sunt evidente prin CMA

CMA oferă informații foarte fiabile cu privire la prezența sau nu a câștigurilor și pierderilor de număr de copii, dar nu oferă informații poziționale sau de orientare. Studiile noastre au arătat că anomaliile structurale au fost observate în 18% din cazurile anormale de CMA. Jumătate dintre rearanjamentele structurale identificate în acest studiu sunt translocații/inserții dezechilibrate, o treime sunt alte modificări structurale, cum ar fi cromozomii inelari, cromozomii marker, izocromosomii și cromozomii izodicentrici, iar restul de 15% sunt rearanjamente complexe. Având în vedere că majoritatea acestor aberații structurale implică regiuni subtelomerice, modificările terminale ale numărului de copii au o probabilitate mai mare de a avea alte anomalii structurale.17 În general, atât analiza cromozomială, cât și analiza FISH sunt capabile să identifice translocațiile, inserțiile, izocromosomii și markerii, cu puncte forte diferite pentru fiecare metodă. Deși FISH poate detecta modificări prea mici pentru a fi detectabile prin analiza cromozomială, analiza modelelor de benzi cromozomiale oferă informații suplimentare cu privire la regiunile implicate. În cazul rearanjamentelor complexe, poate fi necesară combinarea FISH și analiza cromozomială pentru a determina complet modificările structurale complexe. Cu această excepție, analiza FISH în urma unei constatări anormale prin CMA este de obicei adecvată pentru a furniza informații despre natura modificării numărului de copii.

Câteva rearanjamente cromozomiale ar putea fi ratate chiar și după CMA și FISH. De exemplu, o deleție interstițială în 2q a fost detectată prin CMA în cazul 9 ( Figura 1a ). Fără analiza cromozomială, rearanjarea pare a fi o simplă deleție unică, chiar și după analiza FISH de confirmare. Cu toate acestea, examinarea cariotipului a arătat un cromozom 2 anormal cu o inserție a unui segment din 17q23.1q23.3 în banda 2p11.2. În plus, cromozomul 2 cu segmentul 17q inserat prezintă, de asemenea, o inversiune pericentrică între 2p12 și 2q31.1. Cel mai probabil, deleția de pe 2q31.1 detectată de CMA a apărut la sau în apropierea punctului de ruptură al inversiei de pe brațul lung al unui cromozom 2. În concluzie, cazul 9 a avut o rearanjare complexă care includea o deleție în 2q detectabilă prin CMA, dar care nu era vizibilă prin analiza cromozomială, precum și o inserție și o inversie care implicau cromozomii 2 și 17, detectabile prin analiza cromozomială, dar nu prin CMA. În mod similar, cazul 10 a avut rearanjamente de novo care implicau patru cromozomi, inclusiv o inserție a segmentului 2q14.2q24.1 la brațul scurt al unui cromozom 6, care are, de asemenea, o inversie paracentrică, și o translocație reciprocă între cromozomii 12 și 18. Pierderile de număr de copii au fost identificate prin CMA în apropierea punctelor de ruptură din cromozomii 2 și 6 ( Figura 1b ). Un diagnostic corect necesită combinarea CMA și analiza cromozomială.18

Identificarea rearanjamentelor structurale cromozomiale este indispensabilă pentru consilierea genetică a familiei. Dezechilibrele genomice detectate prin CMA s-ar putea datora unei segregări dezechilibrate, produs al unei translocații sau inserții echilibrate la unul dintre părinți și, prin urmare, justifică o recomandare puternică pentru efectuarea de studii parentale. În plus, informațiile structurale cromozomiale oferă un ghid pentru care ar trebui recomandate studiile parentale. Pentru rearanjamentele care sunt susceptibile de a fi produse ale unei rearanjări echilibrate, ar trebui efectuată FISH parentală sau analiza cromozomială în locul CMA parentală.

Raranjamente aparent echilibrate cu un studiu CMA normal

În acest studiu, în 30 de cazuri (~0,8%) au fost detectate translocații sau inversiuni unice aparent echilibrate fără alte anomalii cromozomiale prin analiza cromozomială. S-a raportat că ~40% dintre pacienții cu anomalii congenitale multiple/retard mintal și o translocație aparent echilibrată de novo au anomalii criptice în apropierea punctelor de ruptură sau fără legătură cu punctele de ruptură, care pot fi ușor detectate prin CMA.19,20 Cu toate acestea, CMA nu a detectat nicio modificare a numărului de copii în apropierea punctelor de ruptură în aceste 30 de cazuri. Mai mulți factori pot contribui la această observație. Majoritatea rearanjamentelor au fost moștenite pe baza studiilor parentale ale unui subset de cazuri, ceea ce înseamnă că este mai probabil ca acestea să fie „cu adevărat” echilibrate. În plus, translocațiile robertsoniene, care, de obicei, nu duc la modificări ale numărului de copii ale eucromatinei, au fost incluse în acest studiu, dar excluse în studiile publicate. Mai mult, este posibil ca micile deleții/duplicații criptice adiacente punctelor de ruptură să nu fie observate, deoarece matricile utilizate pentru majoritatea acestor cazuri au fost direcționate și nu au avut o rezoluție genomică suficientă pentru a detecta un dezechilibru.

Deși majoritatea rearanjamentelor echilibrate sunt benigne, rearanjamentele de novo sunt asociate cu un risc mai mare de boală din cauza unei deleții sau duplicații criptice, a întreruperii unei gene sau a unui enhancer, a efectelor de poziție sau a unui efect epigenetic. Riscul de a avea o anomalie congenitală gravă pentru translocațiile și inversiunile reciproce de novo este de 6,7 %.21 Este de așteptat ca riscul să fie mai mic pentru acele cazuri cu o AMC normală care utilizează o matrice a întregului genom. Prin urmare, este mai puțin probabil ca rearanjamentele echilibrate simple detectate în acest studiu să fie cauza fenotipurilor pacienților.

Strategia bazată pe dovezi pentru detectarea eficientă a anomaliilor cromozomiale

Pentru a determina dacă și când trebuie efectuată analiza cromozomială pentru diagnosticul clinic al anomaliilor cromozomiale, am examinat rezultatele cazurilor studiate simultan atât prin CMA, cât și prin analiza cromozomială. Anomalii cromozomiale detectate prin analiza cromozomială, dar complet ratate de CMA, au fost observate în ~1% din cazuri, inclusiv rearanjamente aparent echilibrate în 0,8% din cazuri și dezechilibre asociate cu mozaicismul în 0,16% din cazuri. În plus, analiza cromozomială a facilitat detectarea rearanjamentelor structurale cromozomiale în 18% din cazurile cu rezultate anormale la CMA.

Deși CMA oferă informații despre variația numărului de copii și mozaicism, doar analiza cromozomială sau FISH oferă informații structurale cromozomiale asociate cu aceste modificări ale numărului de copii și identifică unele cazuri de mozaicism nedetectate de CMA. Avantajele FISH față de analiza cromozomială constau în faptul că pot fi detectate modificări ale numărului de copii mici (3-10 Mb) și poate fi analizat rapid un număr mare de nuclee, ceea ce este deosebit de util pentru evaluarea mozaicismului. Prin urmare, după o CMA anormală, analiza FISH poate fi aplicată mai întâi pentru a detecta rearanjamentele structurale asociate cu modificările numărului de copii și pentru a confirma mozaicismul și a determina procentul de celule anormale. Atunci când inserțiile sau translocațiile sunt detectate prin FISH, poate fi indicată analiza cromozomială pentru a determina cromozomii implicați. În locul analizei cromozomiale standard, care studiază 20 de celule în metafază din două culturi, o analiză cromozomială la scară mică a cinci celule dintr-o singură cultură este suficientă în acest scop. Această strategie ar detecta toate modificările structurale, cu excepția câtorva rearanjamente complexe rare.

Pentru cazurile cu un rezultat normal prin AMC, se poate lua în considerare o analiză cromozomială completă dacă pacientul prezintă multiple anomalii congenitale, trăsături dismorfice și/sau retard mental care amintesc de un sindrom cromozomial sau manifestări clinice care indică un mozaicism potențial, cum ar fi anomalii pigmentare care sunt distribuite la întâmplare sau care urmează liniile lui Blashko și asimetrie de creștere în asociere cu dizabilitatea intelectuală. Pe baza acestui studiu, ~1% din cazuri ar avea rezultate cromozomiale informative, dar 0,001 din cazuri (3/3.710) ar avea o constatare semnificativă din punct de vedere clinic.

În concluzie, studiul nostru confirmă în continuare că aproape toate anomaliile cromozomiale detectabile prin analiza cromozomială sunt detectate prin AMC, susținând recomandarea ca AMC să fie testul de prim rang. Cu toate acestea, analiza citogenetică tradițională rămâne utilă pentru detectarea mozaicismului și caracterizarea rearanjamentelor structurale.

.