B. Epitopi ai celulelor B
Ne limităm discuția noastră la epitopi ai celulelor B de pe proteine și peptide; epitopii de pe alți biopolimeri și grupuri haptenice nu sunt abordați. Prima generalizare importantă cu privire la epitopii celulelor B este că aceștia sunt direcționați împotriva caracteristicilor tridimensionale ale suprafeței moleculare a proteinelor și polipeptidelor. O anumită topologie tridimensională este un semn distinctiv al epitopilor celulelor B, spre deosebire de epitopii celulelor T. Este probabil ca orice reziduu de aminoacid accesibil de la suprafața unei proteine să poată face parte dintr-unul sau altul dintre epitopii celulelor B (Benjamin et al., 1984). Prin urmare, proteinele pot conține foarte mulți epitopi diferiți, deși, din motive sterice, doar un număr limitat de anticorpi se pot lega de antigen la un moment dat. Răspunsul celulelor B este stereospecific, fiind mult mai slab împotriva enantiomerilor d ai peptidelor (Gill et al., 1963) și a proteinelor (Dintzis et al., 1993), probabil pentru că proteinele d-enantiomerice nu sunt procesate în mod eficient pentru a produce peptide pentru ajutorul celulelor T.
Anterior, se credea că proteinele au o structură antigenică bine definită, caracterizată de un număr limitat de epitopi. Descoperirea naturii complexe a răspunsului imunitar al celulelor B și a reglării acestuia, precum și a specificității anticorpilor monoclonali față de proteine, a făcut clar faptul că o proteină nu posedă o structură antigenică definită. Nu este posibil să se definească „structura antigenică completă” a unei proteine, contrar a ceea ce au susținut unii cercetători (Atassi și Lee, 1978; Atassi, 1984). Antigenicitatea unei proteine este atât o proprietate a topografiei proteice, cât și a mecanismelor de reglementare ale sistemului imunitar al gazdei, inclusiv toleranța față de structurile care seamănă cu propriile proteine ale gazdei, specificitatea ajutorului celulelor T și rețelele idiotipice (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Siturile imunodominante, adică situsurile către care sunt direcționați majoritatea, dar nu toți anticorpii răspunsului imunitar, nu sunt o proprietate intrinsecă în sine a proteinei. Așa cum au subliniat și alții anterior, epitopii nu există de sine stătător, ci doar în virtutea unei legături cu situsul complementar de legare a anticorpilor, așa-numitul paratop (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Prin urmare, un epitop este un concept relațional, iar definiția unui epitop este în mod necesar operațională (Van Regenmortel, 1986). Cu alte cuvinte, definiția unui anumit epitop depinde în mare măsură de geometria moleculară și de natura chimică a paratopului corespunzător și, poate și mai important, de abordarea experimentală aleasă pentru a cartografia epitopul.
Această stare de fapt poate fi ilustrată prin exemplul primului complex proteină-anticorp a cărui structură a fost rezolvată prin cristalografie cu raze X (Amit et al., 1986). În acest complex, 16 reziduuri de lizozim intră în contact cu 17 reziduuri ale unui Fab (fragment de anticorp) monoclonal al lizozimei. Epitopul se întinde pe 750 Å2 din suprafața lizozimei. În schimb, cartografierea epitopului cu o serie de lizozime aviare cu secvențe asemănătoare indică faptul că doar câteva reziduuri sunt importante pentru legarea lizozimului de anticorpii monoclonali anti-lizozim. Mutarea a foarte puține reziduuri poate reduce radical constanta de asociere a complexului lizozomă-anticorp (Harper et al., 1987). Într-un caz, o singură substituție de la Arg la Lys a redus cu două ordine de mărime afinitatea lizozimei pentru un anticorp monoclonal (Smith-Gill et al., 1982). Calculele teoretice bazate pe structurile cristaline a doi complecși ai lizozimei cu fragmente Fab au demonstrat că, dintre numeroasele reziduuri care definesc epitopul în cristal, doar câteva contribuie de fapt la stabilitatea complexului (Novotny et al., 1989). Pe baza calculelor lor, Novotny și colab. au făcut distincția între un epitop energetic și un epitop pasiv. Epitopul energetic înglobează acele reziduuri care contribuie la energia de legare. Epitopul pasiv asigură doar o complementaritate de suprafață în jurul reziduurilor care formează epitopul energetic. Faptul că numai câteva dintre interacțiunile observate în structura cristalină joacă un rol major în stabilizarea complexului antigen-anticorp a fost confirmat în cazul legării neuraminidazei virusului gripal la un anticorp monoclonal. Nouăsprezece reziduuri ale neuraminidazei intră în contact cu 17 reziduuri ale anticorpului din cristal, dar mutația specifică a doar 3 reziduuri abolește total legătura (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
O distincție operațională mai general aplicabilă a epitopilor este cea dintre un epitop de contact și un epitop funcțional. Epitopul de contact se referă la informațiile obținute din structura tridimensională a complexului antigen-anticorp; epitopul funcțional se referă la informațiile obținute prin proceduri de cartografiere necristalografică, inclusiv cartografierea epitopilor cu peptide. Un epitop de contact este reprezentat de o potrivire între suprafețele mari complementare ale antigenului și anticorpului, așa cum se observă în mai multe structuri cu raze X ale complexelor proteină-anticorp (Davies și Padlan, 1990; Wilson și Stanfield, 1994; Braden și Poljak, 1995). Epitopii de contact acoperă câteva sute de angstromi pătrați de suprafață moleculară. Epitopul funcțional definește reziduurile care par a fi semnificative pentru legarea anticorpilor și a căror mutație poate reduce sau anula total legarea. Epitopul funcțional poate cuprinde doar 2 sau 3 reziduuri, ca în exemplele de lizozimă și neuraminidază menționate mai sus. Nu este posibil să se deducă epitopul de contact din epitopul funcțional. În mod similar, epitopul de contact nu dezvăluie prin el însuși epitopul funcțional. În ceea ce privește anticorpul, se pot diferenția, de asemenea, două tipuri de paratopi: un paratop funcțional și un paratop de contact. Acest lucru rezultă din analiza termodinamică a regiunilor determinante de complementaritate ale unui anticorp monoclonal (Kelley și O’Connell, 1993).
Natura duală a unui epitop, așa cum reiese din tehnicile de cartografiere cristalografică și necristalografică, reflectă două modele diferite de recunoaștere moleculară. Privită astfel, dificultatea de a defini natura epitopilor este deplasată la nivelul unei dificultăți epistemologice: cum să modelăm realitatea prin mijloacele experimentale restrânse pe care le avem la dispoziție? Aceste limite vor fi avute în vedere atunci când vom discuta despre cartografierea epitopilor cu ajutorul peptidelor.
Aici trebuie să menționăm clasificarea conceptuală, cunoscută de mult timp, a epitopilor celulelor B în secvențială și conformațională (Sela et al., 1967; Sela, 1969; Atassi și Smith, 1978). Un epitop se numește secvențial sau continuu dacă poate fi reprezentat de o serie de reziduuri contigue ale unui lanț polipeptidic. Se spune că un anticorp recunoaște un epitop secvențial dacă reacționează cu o peptidă scurtă și flexibilă sau cu lanțul polipeptidic denaturat și desfășurat. Un epitop conformațional, numit și discontinuu sau topografic sau asamblat, este construit din părți necontinue ale secvenței de aminoacizi prin plierea lanțului polipeptidic în proteina nativă. Se spune că un anticorp recunoaște un epitop conformațional dacă reacționează cu o proteină nativă și nu cu lanțul polipeptidic desfășurat, sau dacă reacționează cu o peptidă cu o conformație unică, de exemplu, un helix, dar nu cu o peptidă cu bobină aleatorie.
Distincția dintre epitopi secvențiali și conformaționali este oarecum arbitrară și poate fi înșelătoare. Deoarece fiecare paratop are o structură tridimensională bine definită, interacțiunea dintre paratop și epitop este întotdeauna o potrivire de structuri în spațiul tridimensional. Acest lucru este valabil atât pentru un epitop de pe o proteină globulară bine ordonată, cât și pentru un epitop de pe o peptidă flexibilă scurtă. În acest din urmă caz, peptida trebuie, de asemenea, să adopte o conformație unică atunci când se leagă de anticorp; prin urmare, un epitop continuu este, de asemenea, „conformațional”. Conformația de legare fie preexistă, fie este indusă de paratop (a se vedea secțiunile V,B și V,C).
În cazul anticorpilor împotriva proteinelor native, s-a susținut că majoritatea sau poate chiar toți epitopii sunt discontinui (Barlow et al., 1986). Din cauza dimensiunii mari a unui epitop de contact tipic într-un cristal antigen-anticorp, este într-adevăr puțin probabil ca un anticorp să se lege exclusiv la o porțiune contiguă a lanțului polipeptidic și să nu se lege și la reziduuri de contact depărtate în secvență, dar apropiate în spațiu. Modelele de umplere spațială a proteinelor arată puține întinderi liniare mai lungi de 4 sau 5 reziduuri în legătură peptidică directă accesibile pe suprafața moleculei. Aceasta nu înseamnă că un anticorp îndreptat împotriva unui epitop asamblat la suprafața unei proteine nu poate reacționa încrucișat și cu o peptidă corespunzătoare unui segment al proteinei.
Încheind prezentarea noastră generală a naturii epitopilor celulelor B, subliniem încă o dată dificultatea pură de a da o definiție generală a „epitopului”. Recurgerea pragmatică la definiții operaționale s-ar putea să nu fie pe placul puristului, dar definițiile operaționale pot fi utile pentru a răspunde la întrebări despre caracterul unei anumite interacțiuni antigen-anticorp.
.