Genomul șopârlei anole verzi și o analiză comparativă cu cel al păsărilor și mamiferelor

Linia amniotelor s-a divizat în liniile ancestrale ale mamiferelor și reptilelor cu ∼320 milioane de ani în urmă. Astăzi, membrii supraviețuitori ai acestor linii genealogice sunt mamiferele, care cuprind ∼4.500 de specii, și reptilele, care conțin ∼17.000 de specii. În cadrul reptilelor, cele două clade majore au deviat în urmă cu ∼280 de milioane de ani: lepidosaurii, care conțin șopârle (inclusiv șerpi) și tuatara; și arcaozaurii, care conțin crocodilieni și păsări (poziția broaștelor țestoase rămâne neclară)6. Pentru simplificare, ne vom referi aici la lepidosauri ca șopârle (Fig. 1).

Studiul evenimentelor genomice majore care au însoțit tranziția către un ciclu de viață complet terestru a fost ajutat de secvențierea mai multor mamifere (K.L.-ul.T. et al., manuscris prezentat) și a trei genomuri de păsări2,3,4. Astfel, genomul șopârlei A. carolinensis umple o lacună importantă în acoperirea amniotelor, despărțind ramura lungă dintre mamifere și păsări și permițând o analiză evolutivă mai solidă a genomurilor amniotelor.

De exemplu, aproape toate genomurile reptilelor conțin microcromosomi, dar aceștia au fost studiați la nivel de secvență doar la păsări2,7, ceea ce ridică întrebarea dacă trăsăturile de secvență particulare ale microcromosomilor aviari sunt universale la nivelul microcromosomelor reptilelor8. Un alt exemplu este studiul evoluției cromozomilor sexuali. Aproape toate mamiferele placentare și marsupiale au în comun cromozomi sexuali omologi (XY)9 și toate păsările au în comun cromozomii sexuali ZW. Cu toate acestea, șopârlele prezintă o determinare a sexului fie genetică, fie dependentă de temperatură10. Caracterizarea cromozomilor sexuali ai șopârlelor ar permite studierea cromozomilor sexuali necunoscuți până acum și compararea sistemelor independente de cromozomi sexuali la specii strâns înrudite.

Șopârlele Anolis cuprind o cladă diversă de ∼400 de specii descrise, distribuite în toată zona neotropicală. Aceste șopârle au radiat, adesea în mod convergent, într-o varietate de nișe ecologice cu adaptările morfologice aferente, oferind unul dintre cele mai bune exemple de radiație adaptativă. În special, diversificarea lor în mai multe nișe de replică pe diverse insule din Caraibe prin intermediul concurenței interspecifice și al selecției naturale a fost documentată în detaliu11. A. carolinensis este singurul anoule originar din SUA și poate fi găsit din Florida și Texas până în Carolina de Nord. Am ales această specie pentru secvențierea genomului deoarece este utilizată pe scară largă ca model de reptilă pentru ecologie experimentală, comportament, fiziologie, endocrinologie, epizootie și, din ce în ce mai mult, genomică.

Genomul anolei verzi a fost secvențiat și asamblat (AnoCar 2.0) folosind ADN de la o femelă de șopârlă A. carolinensis (tabelele suplimentare 1-4). Hibridizarea fluorescentă in situ (FISH) a 405 clone de cromozomi artificiali bacterieni (BAC) (de la un mascul) a permis ancorarea scheletelor de asamblare la cromozomi (tabelul suplimentar 5 și figura suplimentară 1). S-a raportat că genomul A. carolinensis are un cariotip de n = 18 cromozomi, care cuprinde șase perechi de macrocromosomi mari și 12 perechi de microcromosomi mici12. Proiectul de secvență a genomului are o dimensiune de 1,78 Gb (a se vedea tabelul suplimentar 3 pentru statisticile de asamblare) și reprezintă o dimensiune intermediară între asamblările genomului păsărilor (0,9-1,3 Gb) și cel al mamiferelor (2,0-3,6 Gb).

Constatăm că au avut loc puține rearanjări cromozomiale în cele 280 de milioane de ani de la divergența dintre anole și pui, așa cum a fost sugerat de comparațiile anterioare folosind Xenopus și pui13. Există 259 de blocuri sintenice (definite ca fiind ancore sintenice consecutive care sunt consecvente în ordine, orientare și spațiere, la o rezoluție de 1 Mb) între șopârlă și pui (tabelul suplimentar 6 și figura suplimentară 2). Este interesant faptul că 19 din 22 de cromozomi de pui ancorați sunt fiecare sintenici cu un singur cromozom A. carolinensis pe întreaga lor lungime (Fig. 2a); prin contrast, doar 6 (din 23) cromozomi umani sunt sintenici cu un singur cromozom de oposum pe întreaga lor lungime, chiar dacă speciile au deviat cu doar 148 de milioane de ani în urmă14. Duplicările segmentare urmează tendințele observate în alte genomuri de amniote (Notă suplimentară, Tabel suplimentar 7 și Fig. suplimentară 3).

Aproximativ 30% din genomul A. carolinensis este compus din elemente mobile, care cuprind o varietate mult mai mare de familii de repetări active decât se observă în cazul genomurilor de păsări2 sau de mamifere15. Cele mai active clase sunt elementele intercalate lungi (LINE) (27 %) și elementele intercalate scurte (SINE) (16 %)16 (tabelul suplimentar 8). Majoritatea repetărilor LINE aparțin la cinci grupuri (L1, L2, CR1, RTE și R4) și par a fi inserții recente, pe baza similarității secvenței lor (divergența variază între 0,00-0,76%; ref. 17). Acest lucru contrastează cu observațiile făcute asupra genomurilor mamiferelor, unde o singură familie de LINEA – L1 – a predominat de-a lungul a zeci de milioane de ani. Transpozonii ADN cuprind cel puțin 68 de familii aparținând la cinci superfamilii: hAT, Chapaev, Maverick, Tc/Mariner și Helitron18. Ca și în cazul retrotranspozonilor, majoritatea familiilor de transpozoni ADN par a fi relativ tinere, spre deosebire de extrem de puțini transpozoni ADN activi recent găsiți în alte genomuri de amniote (tabelul suplimentar 9). În general, elementele mobile din A. carolinensis prezintă un conținut semnificativ mai mare de GC (43,5%, P < 10-20) decât media de 40,3% la nivelul întregului genom. În plus față de elementele mobile, A. carolinensis prezintă o densitate ridicată (3,5 %) de repetări în tandem, cu distribuții ale lungimii și frecvenței similare cu cele ale ADN-ului microsatelit uman15. În prezent, știm că genomurile amniotelor se împart în cel puțin trei tipuri: genomurile mamiferelor sunt îmbogățite pentru elementele L1 și au un grad ridicat de acumulare de elemente mobile, genomurile păsărilor sunt sărace în repetări, cu o activitate foarte redusă a elementelor mobile, în timp ce genomul șopârlei conține o diversitate extrem de mare de familii de elemente mobile active, dar are o rată scăzută de acumulare, ceea ce amintește de profilul elementelor mobile al peștilor teleosteeni19.

Majoritatea genomurilor reptilelor conțin microcromosomi, dar numărul acestora variază în funcție de specie; genomul lui A. carolinensis conține 12 perechi de microcromosomi12, în timp ce genomul puiului conține 28 de perechi. Microcromosomii păsărilor au proprietăți foarte distincte în comparație cu macrocromosomii păsărilor, cum ar fi un conținut mai mare de GC și un conținut mai mic de repetări2, în timp ce microcromosomii șopârlelor nu prezintă aceste caracteristici (Fig. 2b). În mod remarcabil, toate secvențele ancorate în microcromosomii din A. carolinensis se aliniază, de asemenea, la microcromosomii din genomul de pui, iar toate microcromosomurile din A. carolinensis, cu excepția unuia singur, sunt sintenice cu un singur microcromosom de pui corespunzător (Fig. 2a). Astfel, microcromosomii conservați între A. carolinensis și pui ar fi putut apărea în strămoșul reptilei, în timp ce microcromosomii rămași în cazul puiului ar putea fi derivați din descendența păsărilor. Alternativ, microcromosomii de pui rămași ar fi putut fi prezenți în strămoșul reptilelor, dar au fuzionat pentru a forma macrocromosomi în stirpea șopârlelor.

Genomul A. carolinensis are o variație regională surprinzător de mică a conținutului de GC, substanțial mai mică decât cea observată anterior pentru păsări și mamifere; este singurul genom amniotic cunoscut a cărui compoziție nucleotidică este la fel de omogenă ca și genomul broaștei5 (Figurile suplimentare 4 și 5). Figura 3 ilustrează modul în care conținutul local de GC este conservat din punct de vedere evolutiv între cromozomul 14 uman și cromozomul 5 al puiului, dar într-o măsură mult mai mică cu cromozomul 1 al A. carolinensis. Având în vedere că toate genomurile de amniote secvențiate, altele decât A. carolinensis, conțin aceste niveluri variabile omoloage ale conținutului de GC („izocore”)20 , este probabil ca eterogenitatea ancestrală a GC la amniote să se fi erodat spre omogenitate în descendența acestei șopârle. S-a propus ca izocorele cu conținut ridicat de GC să fie o consecință a ratelor mai ridicate de conversie genetică înclinată spre GC în regiunile cu recombinare mai mare2. Omogenitatea mai mare a GC în genomul anolei poate reflecta astfel rate de recombinare mai uniforme sau, în caz contrar, o prejudecată substanțial redusă către GC în timpul rezolvării evenimentelor de conversie genetică în descendența A. carolinensis (pentru o discuție, a se vedea ref. 5).

Atât determinarea sexului dependentă de temperatură, cât și determinarea genetică a sexului XY au fost găsite la Iguania10. În cadrul genului Anolis, există specii cu cromozomi XY heteromorfi (inclusiv cele cu cromozomi X și Y multipli), iar altele cu cromozomi complet homomorfi12. Se știe că A. carolinensis are o determinare genetică a sexului21, dar forma cromozomilor săi sexuali (ZW sau XY) a fost până acum necunoscută din cauza lipsei de cromozomi evident heteromorfi.

Examinarea în profunzime a celulelor masculine și feminine cu ajutorul FISH ne-a permis să identificăm microcromosomul desemnat anterior ca fiind „b” ca fiind cromozomul X al lui A. carolinensis; acesta este prezent în două copii la femele și una la masculi. Acest cromozom este sintenic cu microcromosomul 15 din pui. Unsprezece BAC-uri atribuite la două eșantioane, 154 (3,3 Mb) și chrUn0090 (1,8 Mb), se hibridizează prin FISH cu brațele p ale celor doi cromozomi X la femele și se hibridizează cu brațul p al unui singur cromozom X la masculi (Fig. 4 și Fig. suplimentară 1). Astfel, A. carolinensis prezintă un model reprezentativ pentru un sistem heterogametic masculin de determinare genotipică a sexului. Nu am identificat cromozomul Y, dar presupunem că A. carolinensis posedă atât cromozomi X, cât și Y, deoarece atât celulele masculine, cât și cele feminine conțin același număr de cromozomi.

Cei 5,1 Mb de secvență atribuiți cromozomului X conțin 62 de gene codificatoare de proteine (tabelul suplimentar 10); termenii Gene Ontology (GO) asociați cu aceste gene nu prezintă o îmbogățire semnificativă. Este foarte probabil ca în ansamblul AnoCar 2.0 să existe mai multe secvențe ale cromozomului X care sunt etichetate în prezent ca schele neancorate. Identificarea genei de determinare a sexului din A. carolinensis va necesita o biologie funcțională considerabilă, dar observăm că gena de determinare a sexului din pui DMRT1 este localizată pe cromozomul 2 din A. carolinensis și că SOX3 (paralogul cromozomului X al genei de determinare a sexului din mamiferele theriane SRY) este localizată pe o schelă neancorată din A. carolinensis; astfel, este puțin probabil ca aceste gene să fie gena de determinare a sexului din A. carolinensis.

Toate cele zece gene din A. carolinensis. carolinensis (originari din Carolina de Sud și Tennessee) utilizați pentru cartografierea FISH au prezentat inversiuni pericentromerice mari în unul sau mai mulți dintre cromozomii 1-4, fără nicio corelație între diferitele inversiuni cromozomiale sau cu sexul șopârlei (a se vedea Nota suplimentară, Tabelul suplimentar 11 și Fig. suplimentară. 6).

Un total de 17.472 de gene codificatoare de proteine și 2.924 de gene ARN au fost prezise din ansamblul genomului A. carolinensis (Ensembl release 56, septembrie 2009). Am construit o filogenie pentru toate genealogiile A. carolinensis și omologii lor din alte opt specii de vertebrate (om, șoarece, câine, oposum, ornitorincă, pui, înotător de zebră și peștișor-balon), ceea ce ne-a permis să identificăm un set conservator de 3.994 de ortologi unu-la-unu, adică gene care nu au fost duplicate sau eliminate la niciuna dintre aceste vertebrate de la ultimul lor strămoș comun. Aceste filogenii genetice au fost, de asemenea, utilizate pentru a identifica genele care au apărut prin duplicare în descendența șopârlelor după separarea de descendența aviară și, separat, pe cele care au fost pierdute în descendența mamiferelor după separarea mamiferelor de reptile (Fig. 1, Notă suplimentară, Fig. suplimentară. 7 și tabelul suplimentar 12).

Am găsit 11 gene de opsină din A. carolinensis care nu au ortologi la mamifere (dar au ortologi la nevertebrate, pești și broaște) și, prin urmare, par să se fi pierdut în timpul evoluției mamiferelor (tabelul suplimentar 13). Repertoriul mare de opsine poate contribui la excelenta vedere colorată a anolelor – inclusiv la capacitatea de a vedea în gama ultravioletă – și, de asemenea, poate contribui la hiperdiversitatea lor, permițând evoluția unei colorări diverse, specifice fiecărei specii, a pleoapelor, care are un rol important în selecția sexuală și în recunoașterea speciilor11. În mod similar, genele receptorilor olfactivi și ale β-keratinei sunt puternic duplicate la A. carolinensis (Notă suplimentară și Fig. suplimentară 9).

Multe reptile, inclusiv anolele verzi, diferă de mamiferele placentare prin faptul că sunt ovipare (depun ouă). Vivipariul la mamiferele placentare este o stare derivată, reflectată în pierderea de către acestea a unor gene legate de ouă. Am folosit spectrometria de masă pentru a identifica proteinele prezente în oul imatur al lui A. carolinensis, deoarece majoritatea proteinelor din ouă sunt produse în corpul mamei și apoi transportate în oul imatur. Am constatat că, spre deosebire de mamifere, reptilele au duplicații genetice specifice liniei, inclusiv în vitellogenine (VTGs), apovitellenin-1, ovomucin-α și trei omologi ai ovocalixinei-36, o proteină a matricei cochiliei de ou de găină.

Rezultatele noastre arată o evoluție rapidă a genelor proteinelor ouălor printre amniote. Mai exact, am găsit proteine din 276 de gene de A. carolinensis în ouăle imature de A. carolinensis (tabelele suplimentare 14 și 15), dintre care doar 50 au fost confirmate ca fiind prezente în ouăle de găină prin spectrometrie de masă22,23. Printre aceste gene se numără VTGs, o lizozimă, paralogi ai proteinei 1 a stratului exterior al membranei viteline (VMO1), inhibitori de protează, natterin și nothepsin. Prin alinierea genelor care sunt ortologi unu la unu în A. carolinensis și în pui, am constatat că proteinele din ouă evoluează semnificativ mai rapid decât proteinele din afara ouălor (valori medii dN/dS (raportul dintre rata de substituții nesinonime și rata de substituții sinonime) de 0,186 și, respectiv, 0,135; P = 1.2 × 10-5), ceea ce reflectă o selecție purificatoare redusă și/sau episoade mai frecvente de evoluție adaptativă.

Utilizând mai multe secvențe de genomuri de vertebrate, am identificat trei paralogi VMO1 (pe care îi numim α, β și γ) pe care deducem că au fost prezenți în ultimul strămoș comun al tuturor reptilelor și mamiferelor. În timp ce cel puțin unul dintre VMO1-α, VMO1-β și VMO1-γ a fost pierdut în toate celelalte genomuri de amniote, genomul lui A. carolinensis conține reprezentanți ai tuturor celor trei paralogi. Mai mult, familia VMO1-α specifică de A. carolinensis a crescut la 13 membri și a cunoscut o selecție pozitivă de substituții de aminoacizi în cadrul unei cavități încărcate negativ, probabil de legare a substratului; modificări care, probabil, îi modifică activitatea de transferază asemănătoare lizozimei (Notă suplimentară, Fig. suplimentară 8 și Tabele suplimentare 16 și 17).

Repertoriul de repetări extinse și active de la A. carolinensis ne-a permis să descoperim originea mai multor elemente conservate de mamifere. Prin procesul de exaptare (o schimbare majoră a funcției unei secvențe în timpul evoluției), anumite elemente mobile care erau active în strămoșul amnioților au devenit conservate și, probabil, funcționale la mamifere, rămânând în același timp elemente mobile active la A. carolinensis. Originea acestor secvențe conservate la mamifere în elemente mobile nu a putut fi recunoscută fără o comparație cu o secvență genomică îndepărtată și bogată în repetări24. Am identificat 96 de astfel de elemente exaptate (a se vedea tabelul suplimentar 18) în genomul uman, care se leagă de elemente mobile prezente în strămoșul amnioților și care sunt încă prezente în A. carolinensis, în special familiile CR1, L2 și gypsy.

Deși majoritatea elementelor exaptate sunt necodificatoare și, probabil, îndeplinesc o funcție de reglementare, am identificat, de asemenea, un exon codificator de proteină care a fost exaptat dintr-o LINIE de tip L2, constituind acum exonul 2 într-o regiune N-terminală specifică mamiferelor a proteinei MIER1 (mesoderm induction early response 1). Acest exon este foarte conservat la 29 de mamifere și, prin urmare, reprezintă probabil o inovație mamiferă de la strămoșul amnioților.

TermeniiGO asociați cu situsul de început al transcripției cel mai apropiat de fiecare element exaptat din genomul uman prezintă o îmbogățire pentru genele de neurodezvoltare (a se vedea Metode), „legarea receptorilor de efrină”, „dezvoltarea sistemului nervos” și „transmiterea sinaptică” fiind puternic îmbogățite (toate valorile P < 5 × 10-3). Aceste îmbogățiri sunt în concordanță cu modificările adaptative ale neurodezvoltării care au avut loc în timpul apariției mamiferelor.

Lopârlele Anolis sunt un caz de manual de radiație adaptativă, care s-au diversificat independent pe fiecare insulă din Antilele Mari și în întreaga zonă neotropicală, producând o mare varietate de specii diferențiate din punct de vedere ecologic și morfologic, cu până la 15 specii găsite într-o singură localitate11. Deși anolele sunt utilizate pe scară largă ca sistem model pentru studii comparative filogenetice, a fost dificil să se determine relațiile evolutive dintre cladele majore de anole din cauza radiațiilor evolutive rapide asociate cu accesul la noi dimensiuni de oportunități ecologice. Rezolvarea cu succes a evenimentelor de ramificare relativ scurte asociate cu o astfel de radiație necesită o multitudine de date de la loci care evoluează la o rată adecvată.

Am folosit secvența genomului lui A. carolinensis pentru a dezvolta un nou set de date filogenomice alcătuit din 20 kb de date de secvență eșantionate din toate genomurile a 93 de specii de anole (Tabelele suplimentare 19 și 20). Analizele acestui set de date deduc o filogenie bine susținută care consolidează și clarifică istoria adaptivă și biogeografică a anolelor (Fig. 5, detalii în figura suplimentară 10). În primul rând, analiza noastră filogenomică reafirmă studiile moleculare și morfologice anterioare care indică faptul că specialiști similari ai habitatului anolelor au evoluat independent pe fiecare dintre cele patru mari insule din Antilele Mari. În al doilea rând, analizele noastre sugerează un scenariu biogeografic complex care implică un număr limitat de evenimente de dispersie între insule și o diversificare extinsă in situ în interiorul insulelor. Cele mai apropiate rude ale Anolis se întâlnesc pe continent, iar filogenia confirmă existența a două colonizări, una în sudul Antilelor Mici și cea de-a doua care a produs diverse radiații adaptative în restul Caraibelor. În cadrul acestei din urmă clade, anolele s-au diversificat inițial în primul rând pe cele două insule mai mari din Antilele Mari (deși se pare că și Puerto Rico a fost implicat), înainte de a suferi ulterior radiații secundare pe toate insulele și de a reveni în cele din urmă pe continent, unde această retrocolonizare a produs o radiație evolutivă extinsă. Filogenia indică, de asemenea, faptul că foarte puține evenimente de dispersie între insule au avut loc în evoluția Marilor Antile. Mai degrabă, faunele din Antilele Mari, renumite pentru măsura în care aceleași ecomorfe se găsesc pe fiecare insulă, sunt în principal rezultatul unei evoluții convergente25.

Secvența genomului lui A. carolinensis permite o înțelegere mai profundă a evoluției amniotelor. Completarea acestui important nod reptilian cu un genom secvențiat a dezvăluit stări derivate în fiecare ramură majoră de amniote și a ajutat la iluminarea strămoșului amniotelor. Cu toate acestea, arborele de genomuri de reptile secvențiate este încă extrem de rarefiat, iar secvențierea altor reptile non-aviane ar fi necesară pentru a înțelege pe deplin cât de tipice sunt A. carolinensis și genomurile de păsări secvențiate pentru întreaga cladă de reptile.

Pe lângă utilitatea secvenței genomului A. carolinensis ca reprezentant al reptilelor non-aviane, speciile de Anolis sunt o resursă unică pentru studiul radiației adaptative și al evoluției convergente. Prin invaziile și radiațiile lor ulterioare pe insulele din Caraibe, anolii oferă un analog terestru al peștilor stickleback și cichlid, care au suferit o evoluție adaptativă în medii acvatice separate. La fel cum cercetarea genomică în cazul spinării stickleback a aprofundat studiul speciației ecologice acvatice, un studiu filogenetic genomic la scară largă al anolelor din Caraibe ar fi o oportunitate pentru un studiu detaliat al evoluției adaptative la un animal terestru26; în special pentru că genomurile anolelor conțin un număr mare de elemente mobile active care, conform speculațiilor noastre, ar putea constitui substraturi pentru exaptarea unor elemente de reglementare noi.

.