Clonarea pe bază de topoizomerază (clonarea TOPO) este o metodă de clonare a ADN-ului care nu utilizează enzime de restricție sau ligaze și nu necesită proceduri post-PCR. Sună ușor, nu-i așa? Tehnica se bazează pe capacitatea de bază a perechilor de baze complementare adenină (A) și timină (T) de a se hibridiza și de a forma legături de hidrogen. Această postare se concentrează pe clonarea TOPO „sticky end” (numită și TOPO-TA); cu toate acestea, tehnica de clonare TOPO a fost adaptată și pentru clonarea blunt end.
Deci, cum funcționează clonarea TOPO?
Așa cum este ilustrat în figura de mai jos, supraînălțarea „A” de pe inserția produsului PCR albastru provine din utilizarea Taq polimerazei pentru etapa de amplificare, deoarece Taq polimeraza lasă o singură deoxiadenozină (A) la capetele 3′ ale produselor PCR. „T”-ul complementar din pereche provine de la o coloană vertebrală liniarizată de topoizomeraza I. ADN topoizomeraza I (reprezentată sub forma unui nor verde) funcționează atât ca o endonuclează de restricție, cât și ca o ligază prin clivarea și reunirea capetelor de ADN supraînfășurate pentru a facilita replicarea.
Tehnica TOPO utilizează în mod specific topoizomeraza I izolată de virusul Vaccinia, deoarece această enzimă recunoaște secvența de ADN 5´-(C/T)CCTT-3′ și digeră ADN dublu catenar la această secvență. Energia rezultată din această ruptură este stocată sub forma unei legături covalente între șirul de ADN 3′ scindat și un reziduu tirozil al topoizomerazei I (1). În cazul în care apare o grupare hidroxil 5′ de la o altă catenă de ADN, aceasta poate ataca această legătură covalentă, unind astfel cele două catene de ADN și eliberând topoizomeraza (2).
În zilele noastre, kiturile TOPO disponibile în comerț oferă vectori sau brațe de clonare cu resturi de 3´ deoxitimidină (T) în suspensie care sunt legate covalent de topoizomerază. Vectorii din aceste kituri au, de asemenea, adeseori situsul topoizomerazei inserat într-o casetă de beta-galactosidază, ceea ce permite cercetătorului să efectueze un screening alb-albastru după transformare – unirea automată a capetelor vectorului duce la producerea de colonii albastre care nu trebuie să fie recoltate și secvențiate pentru a găsi clone potențial pozitive. Odată ce introduceți inserția de tip „A” overhang la capătul 3′, are loc magia clonării TOPO.
Procedură de bază
Să defalcăm etapele necesare pentru clonarea TOPO:
1. Creați-vă produsul PCR: Proiectați primeri standard (nu este nevoie să adăugați situsuri de restricție unice la capete) și amplificați secvența dvs. de interes cu polimeraza Taq folosind protocolul PCR preferat.
2. Configurați reacția de clonare TOPO: Amestecați produsul PCR și vectorul TOPO.
3. Incubați 5 minute la temperatura camerei: Puteți pune reacția la gheață dacă intenționați să transformați imediat SAU puteți stoca reacția la -20C peste noapte.
4. Transformați reacția de clonare TOPO în celule competente: Puteți utiliza protocolul dvs. standard de laborator pentru acest lucru; cu toate acestea, ar trebui să reduceți timpul de incubare la gheață la 5 minute (incubarea completă de 30 de minute nu va îmbunătăți semnificativ eficiența transformării).
5. Selectați și analizați 10 colonii albe sau albastru deschis: Puteți confirma prezența inserției dvs. prin PCR, digestie de restricție sau secvențiere.
Sfaturi profesionale
- Nu adăugați fosfați 5′ la amorsele PCR; aveți nevoie de acea grupare hidroxil liberă!
- Puteți dori să includeți un timp de prelungire suplimentar după ultimul ciclu de PCR pentru a vă asigura că „A”-ul este adăugat la toți produsele PCR.
- Rețineți că Taq polimeraza are o rată de eroare de aproximativ 1 la 3.500 de baze. De obicei, polimerazele cu funcționalitate de proofreading sunt utilizate în locul Taq pentru a reduce ratele de eroare; cu toate acestea, polimerazele de proofreading vor elimina, de asemenea, toate capetele 3′ nepereche din produsul PCR. Dacă aveți nevoie să reduceți rata de eroare, vă rugăm să folosiți una dintre aceste metode pentru a vă asigura că inserția dvs. reține supraînălțarea 3′ A:
- Utilizați un amestec de enzime proofreading și Taq, cu Taq utilizat într-un raport de exces de 10:1.
- Purificați pe gel produsul PCR și incubați-l cu tampon, Taq și dATPs la 72C timp de 10-15min.
- Când amestecați produsul PCR cu vectorul TOPO, este posibil să doriți să adăugați sare suplimentară în reacție:
Topoizomeraza I este eliberată din vector atunci când produsul PCR și vectorul se leagă; cu toate acestea, aceasta se poate, potențial, să se lege din nou și să cresteze ADN-ul nou ligat. Sarea ajută la împiedicarea relegării topoizomerazei I, ceea ce duce la obținerea mai multor molecule intacte. (Rețineți că cantitatea de sare pe care o adăugați va depinde de faptul dacă intenționați să vă transformați reacția în E. coli chimic sau electrocompetent – excesul de sare provoacă formarea unui arc electric în timpul electroporării, ceea ce ar duce la eșecul electroporării).
- Când incubați la temperatura camerei, nu se recomandă să depășiți limita de timp de 5 minute (au fost raportate eficiențe de transformare mai scăzute în cazul unei incubări mai lungi); cu toate acestea, este posibil să fie nevoie să incubați timp de 20-30 de minute dacă produsul PCR este la o concentrație scăzută sau dacă clonați un insert extrem de mare.
- Din moment ce reacția standard de ligaturare este destul de rapidă, asigurați-vă că rămâneți organizat și pregătiți tot ce aveți nevoie pentru următoarea etapă înainte de a continua.
- Preîncălzirea plăcii care conține antibiotic înainte de a placa transformarea vă poate permite să vedeți colonii în decurs de 8 ore.
1. Shuman S. „Recombinarea mediată de virusul vaccinia ADN topoizomeraza I în Escherichia coli este specifică secvenței”. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Abordare nouă a clonării moleculare și a sintezei polinucleotidelor folosind ADN topoizomeraza vaccinia. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Resurse suplimentare pe blogul Addgene
- Realizați mutageneza dirijată de situs prin PCR
- Utilizați mutageneza REPLACR pentru a genera cu ușurință inserții și ștergeri într-o plasmidă
- Învățați cum să vă verificați plasmidul
.