Macchio a început să ia lecții de step la vârsta de 3 ani și a fost descoperit de un agent de talente când avea 16 ani. A fost apoi distribuit în rolul lui Jeremy Andretti în serialul de televiziune „Eight Is Enough”. După ce Eight is Enough s-a încheiat, a obținut rolul lui Johnny Cade în filmul The Outsiders din 1983. Acest rol a fost cel care l-a determinat să fie distribuit în rolul lui Daniel LaRusso în filmul din 1984, The Karate Kid și în două dintre continuările sale, The Karate Kid Part II și The Karate Kid Part III. Macchio a apărut în filmul Crossroads din 1986, interpretându-l pe studentul la muzică Eugene Martone. Tot în 1986, Macchio a jucat pe Broadway în Cuba and His Teddy Bear, alături de Robert DeNiro. În 1992, a jucat alături de Joe Pesci și Marisa Tomei în comedia de succes „My Cousin Vinny”, interpretându-l pe Billy Gambini, care a fost acuzat pe nedrept de crimă în timp ce se afla în trecere printr-un mic oraș din Alabama. În 1996, Macchio a interpretat rolul principal al lui J. Pierrepont Finch în turneul american de reluare a musicalului How to Succeed in Business Without Really Trying din 1962, câștigător al premiului Tony, și a primit recenzii pozitive. Referindu-se la interpretarea sa în calitate de corist într-o producție de liceu a aceluiași musical, Macchio a declarat: „Eram cunoscut ca „Dancing Kid”, nu că aș fi fost atât de grozav. Dar dansam de la vârsta de trei ani, luând lecții la Școala de dans June Claire din Babylon, Long Island.”
În 2005, Macchio s-a jucat pe sine însuși în serialul HBO, Entourage. A apărut în videoclipul din 2007 pentru piesa „Sweep the Leg” a trupei No More Kings ca o caricatură a sa și a lui Daniel din The Karate Kid. În 2008, a apărut într-o reclamă VitaminWater în care apărea pilotul NASCAR Carl Edwards. Macchio a fost înfățișat ca „consilier spiritual” al lui Edwards și îmbrăcat în hainele lui Karate Kid. Din octombrie 2008, a apărut în mai multe episoade din serialul de televiziune Ugly Betty al rețelei ABC Network, în rolul lui Archie Rodriguez, un politician local, având un rol semi-regular în serial în calitate de interes amoros al Hildei. În noiembrie 2008, Macchio a fost clasat pe locul 80 în topul VH1 100 Greatest Teen Stars.
În iunie 2010, Macchio a apărut în scurtmetrajul online al Funny or Die, „Wax On, F*ck Off”, în care apropiații săi organizează o intervenție pentru a-l transforma pe fostul copil-vedetă dintr-un familist echilibrat într-un dependent asediat de scandalurile tabloidelor, totul pentru a-și ajuta cariera. În timpul videoclipului, Macchio reacționează când vede un afiș pentru remake-ul din 2010 al filmului Karate Kid. O glumă recurentă în schiță este aceea că Macchio este confundat cu un adolescent. Scurtmetrajul a fost lăudat de Bruce Fretts de la TV Guide, care s-a referit la videoclip ca fiind „sidesplitting” și „aur comic”. La 20 septembrie 2010, Macchio l-a interpretat pe adultul Carl Morelli într-o lectură scenică a piesei lui Charles Messina, A Room of My Own, prezentată de Bleecker Street Theater Company. În februarie 2011 a fost anunțat că va concura în cadrul emisiunii Dancing with the Stars de pe ABC. A fost eliminat în timpul semifinalelor, clasându-se pe locul al patrulea în competiția generală. Macchio a apărut în videoclipurile trupei canadiene Danko Jones pentru piesele „Had Enough” și „I Think Bad Thoughts”, în care mai apar Elijah Wood și Jena Malone.
În aprilie 2012, Macchio a fost distribuit în filmul Hitchcock, bazat pe cartea de non-ficțiune Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, avându-i ca protagoniști pe Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel și Toni Collette, și regizat de Sacha Gervasi. Macchio îl portretizează pe scenaristul filmului Psycho, Joseph Stefano. În 2013, a apărut în How I Met Your Mother. Personajul principal, Barney Stinson, afirmă că personajul lui Macchio, Daniel LaRusso, din The Karate Kid, nu este adevăratul karate kid; în schimb, este Johnny Lawrence, dușmanul lui Daniel în film. În episodul din sezonul 8 „The Bro Mitzvah”, Macchio este invitat la petrecerea burlacilor lui Barney, deși Barney este dezamăgit de surpriză, așteptându-l pe actorul William Zabka, „adevăratul Karate Kid”. Pe toată durata episodului, personajele remarcă asemănările dintre Barney și Macchio, spre dezgustul lui Barney. La sfârșitul serii, clovnul angajat pentru distracția petrecerii se dovedește a fi Zabka. Din februarie până în martie 2016, Macchio a jucat alături de Mario Cantone în producția Off-Broadway A Room of My Own, după ce a citit piesa în 2010 și 2014.
Macchio își reia în prezent rolul lui Daniel LaRusso în Cobra Kai, un serial Netflix de comedie-dramă de acțiune prezentat într-un format de povestire episodică, care a început în 2018. El este, de asemenea, producător co-executiv al serialului, alături de William Zabka. Serialul este plasat la 34 de ani după evenimentele de la Turneul de karate All Valley din 1984 și se învârte în jurul unui Johnny Lawrence (Zabka) aflat la pământ, care – în încercarea de a-și repune viața pe drumul cel bun și de a obține răscumpărarea pentru înfrângerea suferită în turneul din 1984 – redeschide dojo-ul Cobra Kai. Acest lucru reaprinde rivalitatea sa cu un LaRusso acum de succes, care se străduiește să își mențină echilibrul în viața sa fără îndrumarea mentorului său acum decedat, domnul Miyagi.
.