Macchio började ta lektioner i steppdans vid tre års ålder och upptäcktes av en talangagent när han var 16 år gammal. Han fick då rollen som Jeremy Andretti i tv-serien Eight Is Enough. Efter att Eight is Enough avslutades fick han rollen som Johnny Cade i filmen The Outsiders från 1983. Det var denna roll som ledde till att han fick rollen som Daniel LaRusso i filmen The Karate Kid från 1984 och två av dess uppföljare, The Karate Kid Part II och The Karate Kid Part III. Macchio medverkade i filmen Crossroads från 1986, där han porträtterade musikstudenten Eugene Martone. Även 1986 medverkade Macchio i Cuba and His Teddy Bear på Broadway, tillsammans med Robert DeNiro. År 1992 spelade han huvudrollen tillsammans med Joe Pesci och Marisa Tomei i succékomedin Min kusin Vinny, där han spelade Billy Gambini, som felaktigt anklagades för mord när han passerade genom en liten stad i Alabama. 1996 spelade Macchio huvudrollen som J. Pierrepont Finch i den amerikanska turnérevyn av den Tony Award-belönade musikalen How to Succeed in Business Without Really Trying från 1962, och fick positiva recensioner. När han hänvisade till sin roll som körsångare i en gymnasieproduktion av samma musikal sa Macchio: ”Jag var känd som ’Dancing Kid’, inte för att jag var så bra. Men jag hade dansat sedan jag var tre år gammal och tagit lektioner på June Claire School of Dance i Babylon, Long Island.”
Under 2005 spelade Macchio sig själv i HBO-serien Entourage. Han medverkade i 2007 års musikvideo till låten ”Sweep the Leg” av No More Kings som en karikatyr av sig själv och Daniel från The Karate Kid. År 2008 medverkade han i en reklamfilm för VitaminWater där NASCAR-föraren Carl Edwards var med. Macchio avbildades som Edwards ”andliga rådgivare” och var klädd i sina Karate Kid-kläder. Sedan oktober 2008 har han medverkat i flera avsnitt av tv-serien Ugly Betty från ABC Network som Archie Rodriguez, en lokal politiker, med en halvregelbunden roll som Hildas kärleksintresse i serien. I november 2008 var Macchio rankad som nummer 80 bland VH1:s 100 Greatest Teen Stars.
I juni 2010 medverkade Macchio i Funny or Die:s kortfilm ”Wax On, F*ck Off”, där hans nära och kära iscensätter ett ingripande för att förvandla den före detta barnstjärnan från en välanpassad familjefar till en missbrukare belägrad av tabloidskandaler, allt för att hjälpa hans karriär. I videon reagerar Macchio när han ser en affisch för 2010 års Karate Kid-remake. Ett återkommande skämt i sketchen är att Macchio förväxlas med en tonåring. Kortfilmen hyllades av Bruce Fretts från TV Guide, som kallade videon för ”sidospännande” och ”komiskt guld”. Den 20 september 2010 spelade Macchio den vuxne Carl Morelli i en scenisk uppläsning av Charles Messinas pjäs A Room of My Own som presenterades av Bleecker Street Theater Company. I februari 2011 tillkännagavs att han skulle tävla i ABC:s Dancing with the Stars. Han slogs ut i semifinalen och placerade sig på fjärde plats i den totala tävlingen. Macchio medverkade i det kanadensiska bandet Danko Jones musikvideor för ”Had Enough” och ”I Think Bad Thoughts”, där Elijah Wood och Jena Malone medverkade.
I april 2012 medverkade Macchio i filmen Hitchcock, baserad på fackboken Alfred Hitchcock and the Making of Psycho, med Anthony Hopkins, Helen Mirren, Scarlett Johansson, Jessica Biel och Toni Collette, och med regi av Sacha Gervasi. Macchio porträtterar manusförfattaren till Psycho, Joseph Stefano. År 2013 medverkade han i How I Met Your Mother. Huvudpersonen Barney Stinson hävdar att Macchios karaktär Daniel LaRusso i The Karate Kid inte är den riktiga karatekillen, utan att det istället är Johnny Lawrence, Daniels nemesis i filmen. I avsnittet ”The Bro Mitzvah” i den åttonde säsongen bjuds Macchio in till Barneys svensexa, även om Barney blir besviken över överraskningen, då han förväntar sig skådespelaren William Zabka, den ”riktiga Karate Kid”. Under hela avsnittet noterar karaktärerna likheterna mellan Barney och Macchio, till Barneys avsky. I slutet av kvällen avslöjar clownen som anlitats för att underhålla festen att han är Zabka. Från februari till mars 2016 spelade Macchio tillsammans med Mario Cantone i Off-Broadway-föreställningen A Room of My Own, efter att ha läst pjäsen 2010 och 2014.
Macchio återupptar för närvarande sin roll som Daniel LaRusso i Cobra Kai, en actionkomedi-dramaserie på Netflix som presenteras i ett episodiskt berättelseformat, som inleddes 2018. Han är också medverkande producent för serien tillsammans med William Zabka. Serien utspelar sig 34 år efter händelserna i All Valley Karate Tournament 1984 och kretsar kring en nedstämd Johnny Lawrence (Zabka) som – i ett försök att få sitt liv på rätt köl igen och få upprättelse för sitt nederlag i turneringen 1984 – återupptar Cobra Kai dojo. Detta återuppväcker hans rivalitet med en numera framgångsrik LaRusso, som har kämpat för att upprätthålla balansen i sitt liv utan vägledning från sin numera avlidne mentor, Mr Miyagi.