Sistemas induzíveis por tetraciclina têm sido amplamente utilizados em leveduras para estudar o controle da transcrição de genes em células únicas15,16,17,18,19,20,21,22. Para usar a rtTA neste contexto, criamos dois promotores resistentes à doxiciclina com três (PTET3) ou quatro (PTET4) locais de ligação rtTA e utilizamos a variante otimizada rtTA-M27 para controlar a expressão da proteína fluorescente verde enriquecida com levedura (yeGFP)23 a partir destes promotores (Fig. 1a). A fita de expressão rtTA/PTET-yeGFP foi integrada em uma única cópia no genoma da levedura. A variante M2 é idêntica à variante encontrada nos sistemas de expressão avançados Tet-ON da ClonTech.
rtTA-M2 tem atividade significativa na ausência de indução de doxiciclina.
(a) Esquema da configuração experimental onde rtTA-M2 é expresso a partir dos promotores constitutivos PMYO2 ou PTDH3 e yeGFP é expresso a partir de um promotor tet-responsivo. (b) Activação doxiciclina dependente da dose de rtTA-M2 expressa a partir de PMYO2 ou PTDH3 (média +/- s.e.m de três réplicas técnicas). AutoFL é do tipo selvagem BY4742 células de levedura. (c) Distribuições de fluorescência de célula única obtida de células portadoras do sistema PMYO2-rtTA a diferentes concentrações de doxiciclina. Os tons de cinza progressivamente mais escuros correspondem a 0,25, 1, 5 e 100 μg/mL de doxiciclina, respectivamente. O AutoFL é de células de levedura do tipo selvagem BY4742 (d) Imagens de fluorescência brilhante fundidas de células de levedura do tipo selvagem BY4742 ou células não-induzidas portadoras do sistema PMYO2-rtTA.
O problema da transcrição do gene alvo com vazamento é especialmente profundo quando o rtTA é expresso em níveis elevados. Isto é ilustrado na Fig. 1b que mostra as curvas de resposta da dose de doxiciclina PTET3 quando a rtTA-M2 é expressa a partir do forte promotor PTDH3. A fluorescência era muito alta quando as células eram expostas a quantidades saturantes de doxiciclina. No entanto, devido ao vazamento da transcrição do promotor PTET3, a faixa dinâmica do sistema foi bastante pobre com a expressão máxima ~17 vezes maior na indução total em comparação com a ausência de doxiciclina.
Consistente com um modelo onde o transativador tem potencial de ativação significativo em seu estado não induzido, a expressão de rtTA-M2 do fraco promotor PMYO2 reduziu substancialmente a fluorescência na ausência de doxiciclina. Embora a saturação total não tenha sido observada com este sistema, a redução da expressão de vazamento resultou em uma melhora drástica na faixa dinâmica e a indução com doxiciclina resultou em um aumento de ~200 vezes na fluorescência. Entretanto, apesar desta melhora, tanto os dados da citometria de fluxo (Fig. 1c) quanto os dados da microscopia de fluorescência (Fig. 1d) indicaram que o rtTA-M2 não induzido causa expressão significativa do gene repórter mesmo quando o transativador é expresso a partir de um promotor fraco.
Durante o teste inicial de doze clones portadores do sistema PTDH3-rtTA-M2, descobrimos serendipidamente que um deles emitia uma fluorescência inesperadamente baixa na ausência de doxiciclina, mas fluorescência quase normal na indução total (Fig. 2a). O sequenciamento subsequente identificou uma única mutação nucleotídica, guanina para timina, que muda uma glicina (GGG) para uma valina (GTG) no resíduo 72 dentro da proteína do transativador. A análise Western blot analysis indicou que essa substituição não afeta a abundância de proteínas (Fig. 2a, Insert, ver Fig. S1 suplementar para detalhes) e a reconstrução do sistema de expressão confirmou que a mutação de guanina simples para timina é responsável pelas mudanças observadas na resposta da dose de doxiciclina (dados não mostrados).
Mutation of glycine 72 in rtTA-M2 diminui a atividade basal para níveis indetectáveis.
(a) Doxiciclina activação dependente da dose de variantes rtTA-M2 expressa a partir de PTDH3 (média +/- s.e.m de três réplicas técnicas). AutoFL é do tipo selvagem BY4742 células de levedura. No inset, uma mancha ocidental (cultivada) comparando as abundâncias proteicas tanto do rtTA-M2 como do mutante G72V. Todas as amostras foram preparadas e executadas em condições experimentais idênticas. (b) Distribuições de fluorescência unicelular obtida de células portadoras do sistema PTDH3-rtTA(G72V) em diferentes concentrações de doxiciclina. AutoFL é do tipo selvagem BY4742 células de levedura. Os tons de cinza progressivamente mais escuros correspondem a 1, 2,5, 5 e 100 μg/mL de doxiciclina, respectivamente. (c) Imagens de fluorescência brilhante fundidas de células não induzidas portadoras dos sistemas PTDH3-rtTA-M2 ou PTDH3-rtTA(G72V). (d) Representação cartoon de TetR dimer em que cada protomer é colorido de forma diferente (amarelo e turquesa). A estrutura secundária é rotulada e G72 é mostrada como uma esfera.
O sistema PTDH3-rtTA-M2(G72V) tem uma notável faixa dinâmica e mostrou um aumento de ~500 dobras na intensidade de fluorescência quando as células foram induzidas com alta doxiciclina em comparação a nenhuma indução (Fig. 2b). Além disso, a emissão de fluorescência detectada pela citometria de fluxo é indistinguível da autofluorescência celular na ausência de doxiciclina e a variante preserva a resposta de indução graduada do transativador original. Além disso, a expressão da cepa rtTA-M2(G72V) não induzida era indetectável por microscopia de fluorescência, mesmo em instrumentos onde a cepa rtTA-M2 não induzida dava um forte sinal de saturação (Fig. 2c).
Para obter uma visão de como a mutação única pode ter um impacto tão drástico na faixa dinâmica do rtTA-M2(G72V), investigamos onde o resíduo estava localizado no contexto da estrutura tridimensional da proteína. A estrutura do rtTA-M2 ou de outras variantes rtTA não foi resolvida. Entretanto, com 203 dos 207 aminoácidos no domínio TetR da rtTA sendo preservados7, a estrutura de alta resolução do TetR24 dá uma visão da estrutura do domínio de ligação do DNA rtTA. Na estrutura de TetR, o resíduo de glicina 72 mapeia para um laço flexível localizado entre α-helices α4 e α5, uma região que liga o domínio repressor de ligação do DNA (α1-α3) e sua região de ligação da tetraciclina (α5-α9)24,25 (Fig. 2d). Isso sugere que a substituição, que introduz uma cadeia lateral não polar, desencadeia mudanças conformacionais de longo alcance que, em última instância, afetam a atividade do transativador, presumivelmente pela rigidez de sua estrutura terciária.
Para examinar essa hipótese, criamos duas variantes adicionais nas quais o resíduo de glicina foi mutado em alanina ou prolina. Estas mutações preservam a natureza não-polar do resíduo valino, mas introduzem cadeias laterais de tamanho variável. Prevemos que a cadeia lateral única de metil de alanina seria menos eficaz na prevenção da atividade não induzida do que a grande cadeia lateral cíclica da prolina. Também criámos um sistema de expressão induzível de estradiol26 em β para obter o controlo directo da expressão rtTA-M2 e utilizámos o promotor com um local de ligação extra de TetR, PTET4, para aumentar a capacidade da rtTA de ligar o ADN. O sistema de expressão é ilustrado esquematicamente em (Fig. 3a). Nós confirmamos pela análise do western blot que as quatro variantes rtTA são expressas em níveis similares na indução total de β-estradiol (Fig. 3b, veja a Fig. S2 Suplementar para detalhes) e que a fluorescência de uma cepa sem rtTA tem expressão repórter que é indistinguível de uma cepa de levedura do tipo selvagem BY4742, demonstrando que não há expressão repórter de fundo do PTET4 (Fig. Suplementar S2 para detalhes). S3).
cadeias laterais não-polares no resíduo 72 é um determinante chave da atividade basal.
(a) Esquema da rede genética onde as variantes rtTA-M2 são expressas a partir de um promotor induzível de estradiol β e o yeGFP é expresso a partir de um promotor tet-responsivo. (b) Western blot (cultivado) comparando as abundâncias proteicas de todas as quatro variantes rtTA quando induzidas por 1000 nM de β-estradiol ou sem indução. Todas as amostras foram preparadas e executadas em condições experimentais idênticas. (c) Imagens de fluorescência brilhante fundidas de todas as quatro variantes rtTA induzidas por 1000 nM de β-estradiol, sem indução de doxiciclina. (d) A atividade basal das variantes rtTA em função do seu nível de expressão dependente do estradiol β (média +/- s.e.m de três réplicas técnicas). No inset, histogramas de expressão dos repórteres para as diferentes variantes rtTA. (e) Ativação dependente da dose de Doxiciclina das variantes rtTA-M2 expressas ubiquitalmente em 1000 nM β-estradiol (média +/- s.e.m de três réplicas técnicas).
Como esperado, a variante alanina mostrou maior expressão de fuga do que a variante valina e a variante prolina tinha fluorescência que era indistinguível da autofluorescência celular medida pela citometria de fluxo. Isto é aparente nas imagens de microscopia de fluorescência obtidas com configurações de instrumentos onde a cepa que abriga a variante M2 original dá um forte sinal de fluorescência na indução total de β-estradiol (Fig. 3c) e nas medições de fluorescência por citometria de fluxo na indução variável de β-estradiol (Fig. 3d).
Completamente, as substituições de aminoácidos que reduzem significativamente a expressão gênica do reportador basal têm efeito mínimo na ativação transcripcional da rtTA na indução total de β-estradiol e doxiciclina. Isto é ilustrado na Fig. 3E, que mostra as curvas dose-resposta para as quatro variantes de G72-M2 medidas quando a doxiciclina é variada na indução completa do β-estradiol. No entanto, as substituições de aminoácidos influenciam a sensibilidade à doxiciclina. Em nossos experimentos (Fig. 3e), a variante M2 teve a maior sensibilidade com meia concentração máxima efetiva (EC50) de ~0,06 μg/mL enquanto a variante alanina (EC50 de ~0,2 μg/mL), a variante valina (EC50 de ~1,0 μg/mL) e a variante prolina (EC50 de ~1.5 μg/mL) exigiu concentrações progressivamente maiores de doxiciclina para atingir a capacidade máxima de expressão.
Para contrariar o efeito da mutação G72 na sensibilidade à doxiciclina, introduzimos mutações adicionais no domínio TetR que recentemente mostraram aumentar a sensibilidade à doxiciclina10,11,27. Examinamos especificamente o efeito da introdução das mutações de aumento da sensibilidade (SE) V9I, F67S, F86Y e R171K.
Figure 4A,B demonstram que as mutações SE melhoram a sensibilidade à doxiciclina das variantes SE-G72P e SE-G72A rtTA M2. Quando as variantes rtTA são expressas em altos níveis a partir do promotor totalmente ativado β-estradiol induzível (Fig. 3a), a introdução das mutações SE reduz a doxiciclina EC50 de ~1,5 μg/mL para ~0,1 μg/mL para a variante G72P (Fig. 4a) e de ~0,2 μg/mL para ~0,02 μg/mL para a variante G72A (Fig. 4b). Este efeito ocorreu sem uma mudança apreciável na expressão do repórter sob indução total de doxiciclina e não comprometeu a faixa dinâmica da variante SE-G72P. Curiosamente, entretanto, as mutações SE causaram uma perda significativa da faixa dinâmica para a variante SE-G72A ao aumentar a expressão do gene repórter na ausência da doxiciclina.
Sensibilidade das novas variantes rtTA à doxiciclina pode ser melhorada com a adição de mutações que aumentam a sensibilidade.
(a,b) Activação dependente da dose de Doxiciclina das variantes rtTA expressas ubiquitalmente em 1000 nM β-estradiol (média +/- s.e.m de três réplicas técnicas). (c-f) Heatmaps exibindo a expressão repórter (unidades arbitrárias) em função da expressão transativadora dependente de estradiol e indução de doxiciclina β.
Para explorar melhor a relação entre o nível de expressão rtTA, doxiciclina EC50 e atividade basal, examinamos o efeito na expressão gênica repórter da variação simultânea β-estradiol e indução de doxiciclina. Investigamos quatro variantes diferentes de M2; a variante original, a variante orginal com as mutações SE, a variante G72P e a variante SE-G72P.
A superfície dose-resposta bidimensional para a variante M2 original contém três regiões distintas de expressão do gene repórter correspondentes à expressão do gene repórter baixo, intermediário e alto. Estas regiões estão rotuladas I, II e III na Fig. 4c-f. A região III é onde a expressão do declarante é máxima, o que depende tanto do nível de expressão rtTA quanto do nível de indução da doxiciclina. A região II é onde a expressão do repórter é relativamente alta mesmo quando a indução da doxiciclina é baixa. A região I é onde a expressão do repórter é baixa devido à baixa β-estradiol ou baixa indução de doxiciclina.
As mutações SE sozinhas (Fig. 4d) aumentam drasticamente a expressão do repórter em parte da região I e em toda a região II. Isso confirma que essas mutações podem aumentar a sensibilidade em uma faixa estreita de níveis de expressão rtTA, mas também causar um aumento significativo na atividade da rtTA no estado não-induzido. Contrastando com isso, a mutação do G72P por si só (Fig. 4e) reduz drasticamente a expressão do repórter em toda a região II e em parte da região III. Isto confirma que o efeito profundo desta mutação na atividade da rtTA no estado não induzido está associado com uma perda geral da sensibilidade à doxiciclina.
Figure 4f mostra o efeito da combinação das mutações SE e G72P. Comparado com a variante SE (Fig. 4d), a adição da mutação G72P conta o aumento da expressão do relator causado pelas mutações SE na região I e reduz a expressão do relator a níveis indetectáveis nesta região. Além disso, em comparação com a variante G72P (Fig. 4e), a adição das mutações SE restaura quase completamente a perda de expressão do repórter na região III. Em outras palavras, a sensibilidade é melhorada sem a introdução da expressão do gene alvo com vazamento em qualquer nível de expressão do transativador.