Caracterização do anti-inflamatório Lactobacillus reuteri BM36301 e seus benefícios probióticos em ratos idosos

Caracterização das bactérias probióticas do ácido láctico

Isolamos há anos bactérias do ácido láctico (LAB) de várias fontes, incluindo seres humanos, animais, plantas e produtos alimentares. Estas coleções de Microorganismos Benebios (BM) são compostas por mais de 500 cepas, com potenciais probióticos revelados a partir de suas triagens iniciais. Neste estudo, escolhemos quatro cepas comensal humanas derivadas de amostras fecais e estudamo-las mais detalhadamente (Tabela 1). As examinadas especificamente foram duas cepas de Lactobacillus reuteri (BM36301 e BM36304), uma cepa de L. gasseri (BM33601), e uma cepa de Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Examinamos as bactérias com respeito às suas qualificações gerais como probióticas (Tabela 1). Primeiro, essas cepas de BM mostraram resistência contra ácidos (pH 2,5) e sais biliares (0,3 %), demonstrando uma faixa de sobrevida de 43% a 98,5% após 1 h de tratamento a 37 °C, que são escores razoavelmente altos . Em seguida, testamos as atividades antimicrobianas contra bactérias entéricas. Enquanto L. gasseri BM33601 mostrou uma inibição mínima da cepa de teste E. coli, todas as outras formaram zonas inibitórias distintas (0,5-3 mm de distância das bordas LAB). Estes efeitos inibitórios são geralmente causados por bacteriocinas, ácidos orgânicos (ácido láctico ou ácido acético), peróxido de hidrogênio, ou etanol do LAB . Finalmente, analisámos a sua capacidade de ligação às células epiteliais do intestino humano (IECs) in vitro. Para este fim, cultivamos células humanas de câncer de cólon, HT-29, em lamelas por 15 dias e aplicamos culturas vivas de LAB por 1 h (Métodos). Após extensa lavagem, as restantes células bacterianas foram visualizadas por coloração de Gram para contagem ao microscópio. As cepas BM36301 e BM36304 de L. reuteri apresentaram altos escores de retenção (5,5-7,4 bactérias por HT-29), enquanto L. gasseri BM33601 teve escores moderados (1,7 bactérias por HT-29) e B. animalis subsp. lactis BM10307 teve escores baixos (0,3 bactérias por HT-29). Uma adesão mais forte do LAB aos IECs é particularmente importante uma vez que eles precisam permanecer na camada mucosa intestinal o tempo suficiente para que os benefícios tenham efeito sobre o hospedeiro . A partir destas experiências primárias, as duas cepas de L. reuteri revelaram um potencial superior como probióticos de qualidade.

Regulação da produção de TNF-α por bactérias lácticas in vitro

P>Temos como objectivo a filtragem do LAB para o seu potencial de supressão da inflamação intestinal. Para isso, adaptamos um sistema de cultura de tecidos in vitro onde as células mielóides humanas (THP-1) segregam TNF-α após ativação de seus receptores Toll-like (TLR) por lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) . Primeiro, verificamos que células de THP-1 de 5 × 104 em cultura de 1 ml tratadas com LPS na dosagem de 150 ng/ml durante 3,5 h geralmente resultaram numa produção de 200-300 pg/ml de TNF-α (Fig. 1a, faixas 1 e 2). Em seguida, coletamos os sobrenadantes das culturas bacterianas cultivadas durante 24 h, secamos a vácuo e reconstituímos o meio condicionado (CM) (Métodos). Este CM contém atividades complexas para suprimir e induzir TNF-α, dependendo das condições do LAB e da cultura. De fato, observamos uma ligeira produção de TNF-α pelas CM da BM36304 e BM36301 sem LPS, mas essa quantidade foi inferior a 20% da indução estimulada por LPS (dados não mostrados). Finalmente, adicionamos cada CM até 5% de cultura de THP-1 (v/v) na presença de LPS (Fig. 1a, faixas 3-6). A produção de TNF-α com LPS (208 ± 49 pg/ml, pista 2) foi suprimida para 40% com a CM de L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, pista 3), e para 52% com a CM de B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, pista 6). Para nosso rastreio, consideramos a supressão da TNF-α próxima ou inferior a 50% da expressão pelo tratamento LPS como anti-inflamatório. Entretanto, os CMs de L. reuteri BM36304 e L. gasseri BM33601 não foram capazes de suprimir a produção de TNF-α até aquele ponto. Verificamos essa atividade inerte preparando essas CMs sob várias condições de cultura (dados não mostrados).

Next, examinamos a capacidade de indução de TNF-α das próprias células bacterianas porque os componentes celulares das bactérias Gram positivas podem induzir respostas inflamatórias. Para este fim, cultivámos bactérias até uma fase exponencial (16 h), depois colhemos, lavámos e adicionámos estas células bacterianas vivas em excesso (contagem de células 250 vezes superior) à cultura de THP-1. As actividades metabólicas das células bacterianas foram mantidas minimizadas pelos antibióticos adicionados no meio THP-1. Após 6 h de incubação, o TNF-α segregado foi medido quantitativamente (Fig. 1b). Embora todas as quatro células LAB tenham induzido TNF-α, a BM36301 produziu uma quantidade significativamente menor (609 pg/ml) do que as outras: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml), e BM10307 (7141 pg/ml). Durante esta co-incubação de 6 horas, observamos que as células THP-1 sofreram morte de células variáveis dependendo do LAB utilizado (arquivo adicional 1). Mais notavelmente, BM36301, o indutor de TNF-α mais baixo, causou a menor quantidade de morte de THP-1 (9,7 %), enquanto as outras cepas de TNF-α mais altas causaram mortes significativamente mais proeminentes (24-38 %). Portanto, não é o caso de BM36301 ter induzido baixo TNF-α devido à perda de viabilidade do THP-1 per se. Para o nosso rastreio, considerámos como pró-inflamatório LAB com produção activa de TNF-α superior a 1000 pg/ml.

Em resumo, as actividades de imunomodulação in vitro foram atribuídas como anti-inflamatórias com a CM supressora (BM36301 e BM10307) e pró-inflamatórias com as células vivas indutivas (BM36304, BM33601 e BM10307). Como BM10307 mostrou ambas as atividades, nós o designamos como possuindo dupla funcionalidade (Fig. 1c). Foi interessante notar que as duas cepas de L. reuteri apresentaram atividades distintas. A partir do rastreio inicial da nossa vasta gama de colecções de BM, as cepas anti-inflamatórias revelaram-se bastante raras, com uma taxa de descoberta inferior a 5% (dados não mostrados). Também algumas cepas não mostraram atividade alguma, caindo assim na categoria de ‘neutras’ (dados não mostrados).

As moléculas superpressivas nas CMs são estáveis contra o calor e a tripsina

Desde que a CM do LAB é composta de vários metabólitos bacterianos bem como componentes celulares, procuramos entender melhor a natureza anti-inflamatória da CM. A expressão de TNF-α diminuiu quantitativamente com o aumento das concentrações de CM de L. reuteri BM36301 (Fig. 2a) e B. animalis subsp. lactis BM10307 (Fig. 2b). Curiosamente, uma menor quantidade de CM de BM36301 (0,5× entrada ou 2,5% v/v) induziu de fato TNF-α, consistente com a observação de que esta CM contém materiais indutores de TNF-α até certo ponto (Fig. 2a, faixas 2 e 3). No entanto, os efeitos supressores tornaram-se dominantes face a maiores quantidades de CM, sugerindo que os materiais anti-inflamatórios são quantitativamente aditivos e que os receptores correspondentes na superfície da célula THP-1 são suficientemente abundantes para responder prontamente ao aumento do tratamento com CM. Em geral, estas observações sugerem que os CM contêm metabolitos ativos responsáveis pela supressão de TNF-α, apesar da sua natureza complexa.

Examinamos ainda as características físico-químicas dos materiais anti-inflamatórios nas CMs. A ebulição dos CM de cada estirpe durante 10 min foi considerada ineficaz na alteração de suas funções inibitórias de TNF-α em comparação com os CM nativos (Fig. 2c, faixas 3 e 4). Da mesma forma, o tratamento com tripsina não afetou suas atividades (Fig. 2c, pista 5). Estas observações sugerem que os principais fatores inibitórios destas CMs não são proteínas nem moléculas sensíveis ao calor.

Regulação da TNF-α em ratos com bactérias probióticas

A última questão em relação à regulação in vitro da TNF-α com base na nossa triagem LAB foi o quão relevante seria com as aplicações in vivo. Procuramos responder diretamente a esta pergunta aplicando as cepas selecionadas de L. reuteri a um sistema modelo de mouse. Preparamos camundongos C57BL/6 de 6 machos e 8 fêmeas por grupo, com 20 semanas de vida. Em seguida, durante 20 semanas, um grupo foi tratado com o anti-inflamatório BM36301, outro grupo foi tratado com o pró-inflamatório BM36304 e o grupo controle foi tratado com dextrose (Métodos). Como forma de minimizar o sofrimento dos animais, as culturas LAB foram administradas através de água potável para atender a dosagem de consumo diário de 1 × 106 bactérias por rato. Também foi fornecida uma dieta padrão para que o processo de envelhecimento fosse natural durante o período. Ao final das 20 semanas de incubação (total de 40 semanas de idade), nós eutanizamos os ratos e retiramos sangue para a preparação do soro para medir citocinas e testosterona usando métodos ELISA quantitativos. Ao realizarmos a necropsia, não encontramos anormalidades morfológicas brutas.

Em resumo, observamos uma redução do soro TNF-α com o anti-inflamatório BM36301, com um efeito mais pronunciado observado nas fêmeas. O pró-inflamatório BM36304 levou a um aumento de TNF-α nos machos, mas não nas fêmeas. Estes achados sugerem que nossa triagem in vitro tem relevância significativa com a manutenção in vivo de TNF-α nestes ensaios em camundongos.

L. reuteri BM36301 manteve um ganho de peso corporal reduzido e alta testosterona em camundongos masculinos

Aging é a fonte de muitos problemas de saúde em humanos, incluindo diabetes e obesidade. A fim de exacerbar esses problemas de envelhecimento no modelo animal, dietas com alto teor de gordura são frequentemente empregadas. No entanto, a interpretação dessas experiências aceleradas pode ser complicada, uma vez que nenhum envelhecimento em humanos deve ser impulsionado por uma dieta propositadamente rica em gordura. Cultivamos todos os ratos com uma dieta padrão para que o seu processo de envelhecimento pudesse ser mais natural. Nas experiências de 20 semanas a partir da idade de 20 semanas, os machos do grupo de controlo ganharam cerca de 8 g de peso (7,83 ± 1,2 g) e as fêmeas do grupo de controlo ganharam cerca de 5 g de peso (4,8 ± 0,94 g). Notavelmente, notou-se que o ganho de peso em machos alimentados com o anti-inflamatório BM36301 foi significativamente menor que no grupo controle (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040) em 36 % (Fig. 4a, faixas 1 e 2). Entretanto, o ganho de peso dos machos tratados com BM36304 (7,53 ± 0,74 g) não foi significativamente diferente do controle (p = 0,67). Os ganhos de peso dos grupos femininos não foram estatisticamente diferentes uns dos outros.

Outra diferença significativa foi o nível sérico de insulina dos homens tratados com BM36304 (Fig. 4b). Enquanto o grupo masculino controle apresentou 3,18 ± 0,65 ng/ml de insulina, o grupo masculino BM36304-fed apresentou 4,91 ± 0,63 ng/ml de insulina (p = 0,027). No entanto, de acordo com a constatação de que o ganho de peso deste grupo não foi muito diferente do controle (Fig. 4a), não observamos um acúmulo mais proeminente de gordura abdominal em homens tratados com BM36304 (dados não mostrados). Com 40 semanas de idade, o pico de insulina pode não ter causado diabetes clinicamente evidente nos ratos, mas a doença pode ter-se tornado mais pronunciada se os ratos envelhecerem mais. A variação da insulina entre os grupos femininos não foi significativamente diferente entre si.

Finalmente, focalizamos os níveis de testosterona dos homens. Como mostrado na Fig. 4c, o anti-inflamatório BM36301-macho reteve níveis significativamente maiores de testosterona sérica (5,18 ± 0,87 ng/ml) do que o grupo controle (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Entretanto, o grupo tratado com BM36304 não foi estatisticamente diferente (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) do grupo controle. A fim de compreender melhor os resultados da testosterona, examinamos os testículos de cada rato. O peso dos testículos pareados dos machos alimentados com BM36301 foi de 0,579 ± 0,075 g, 10 % mais pesado que o dos controles (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Considerando o menor ganho de peso no grupo BM36301 (Fig. 4a), essa diferença de tamanho dos testes é mais evidente; a relação entre o peso dos testes e o ganho de peso corporal (TW/WG) do controle foi de apenas 67% do do grupo BM36301. Entretanto, não pudemos observar diferenças microscópicas dos tecidos dos testes, como o diâmetro dos túbulos seminíferos entre esses dois grupos (156,03 ± 6,65 μm do controle vs. 153,95 ± 18,66 μm do sexo masculino tratado com BM36301, p = 0,51). Não realizamos outros estudos como comparação de espermatogênese ou área celular de Leydig.

Em resumo, o anti-inflamatório BM36301 ajudou os machos a manter um menor ganho de peso com testículos maiores e mais testosterona à medida que envelheciam. A redução da produção de testosterona em homens idosos foi proposta para ser relacionada com lesões dependentes da idade nos testículos, presumivelmente como resultado de um insulto inflamatório. Enquanto isso, o pró-inflamatório BM36304 desencadeou um aumento de insulina, embora sem alterações no ganho de peso ou testosterona entre os homens. Notavelmente, nenhuma destas estirpes bacterianas teve influência significativa sobre estas medidas corporais em ratos fêmeas.

Pele feminina saudável do anti-inflamatório BM36301

Uma característica interessante de certos probióticos é que eles podem promover a saúde da pele de uma maneira dependente da regulação imunológica . Como o BM36301 também mostrou efeitos anti-inflamatórios in vitro e in vivo, colocámos a questão se esta estirpe pode provocar tais benefícios para a saúde da pele. Na 18ª semana de tratamento, depilamos uma área em 2 ratos de cada grupo e os examinamos após 1 semana. Curiosamente, os ratos fêmeas BM36301-fed exibiram um crescimento de pêlos mais rápido, embora não tenham recuperado completamente, na área raspada (Fig. 5a). Em contraste, os grupos controle ou BM36304 não exibiram um ritmo de recuperação tão rápido. Nenhum dos machos tratados mostrou crescimento de pêlos distinguivelmente mais rápido do que o controle, indicando que este crescimento acelerado dos pêlos pode ser óbvio apenas nas fêmeas. Outra métrica para avaliar a saúde da pele é examinar o brilho do pêlo. Entretanto, não observamos diferenças significativas entre cada grupo através de medidas sensoriais ou de medidores de luz, principalmente devido às condições relativamente brilhantes do pêlo dos controles (dados não mostrados).

Avaliamos ainda mais a saúde da pele examinando ao microscópio cortes transversais de pele após a coloração com Hematoxilina e Eosina. Como mostrado nas Figuras 5b e c, verificamos que os ratos fêmeas tratadas com BM36301 apresentaram maior contagem de folículo piloso subcutâneo (HF) do que os ratos fêmeas controle. As contagens de HF por visão microscópica com resolução de 400× foram de 3,50 ± 0,52 para o grupo feminino controle, enquanto as contagens foram de 4,80 ± 0,61 para as fêmeas BM36301 alimentadas, com diferença significativa (p = 0,023). Entretanto, as fêmeas tratadas com BM36304 apresentaram apenas uma pequena alteração (4,15 ± 1,73, p = 0,55 vs. controle). Após uma análise mais detalhada dos folículos pilosos, constatamos que as fêmeas com BM36301 apresentaram estágios do ciclo piloso marginalmente mais ativos do que o controle (anágeno + catágeno: telógeno foi 81:19 do controle vs. 95: 5 das fêmeas com BM36301). Entretanto, as contagens de AF dos grupos de machos não foram muito diferentes umas das outras (Fig. 5b). Finalmente, também avaliamos a espessura da pele medida como a profundidade desde a epiderme até o panniculus carnosus (Fig. 5c, arquivo adicional 1). Não encontramos muita diferença de profundidade entre as fêmeas controladas e as tratadas com BM36301. No entanto, as camadas dérmicas dos ratos alimentados com BM36301 provaram ser marginalmente mais profundas do que as dos controles, e o tecido adiposo dos ratos tratados com BM36301 era mais superficial do que o do controle. A maioria das HF subcutâneas foram encontradas na derme.

Overall, estas observações sugerem que o tratamento com anti-inflamatórios BM36301 favoreceu uma pele mais saudável, como evidenciado pelo crescimento de pêlos e contagens de HF nas fêmeas. Entretanto, as diferenças microscópicas das amostras de pele entre os grupos controle e BM36301 pareceram bastante marginais. Estes benefícios para a saúde da pele não foram observados nos homens. Além disso, o pró-inflamatório BM36304 não causou nenhum efeito adverso na pele no momento das experiências.