Análise cromossômica e CMA são ferramentas de diagnóstico clinicamente úteis para detectar anormalidades cromossômicas em todo o genoma humano. Atualmente, a CMA é recomendada como o teste de primeira linha para incapacidade intelectual e defeitos congênitos, substituindo o papel anterior da análise cromossômica. Neste estudo, comparamos os resultados da análise cromossômica e CMA em 3.710 casos para determinar o valor da realização da análise cromossômica.
- Detecção máxima do mosaicismo por uma conjunção de CMA e análise citogenética tradicional
- A informação estrutural cromossômica é fornecida pela análise cromossômica, mas não aparente pela CMA
- Rearranjos aparentemente equilibrados com um estudo CMA normal
- Estratégia baseada navidência para detecção eficiente de anomalias cromossômicas
Detecção máxima do mosaicismo por uma conjunção de CMA e análise citogenética tradicional
Este estudo mostrou que 1,2% (43/3.710) dos pacientes tinham um achado em mosaico. O mosaicismo foi observado apenas pela análise cromossômica em 39% dos casos devido a um percentual muito baixo (<10%) ou muito alto (>80%) de células anormais, enquanto 12% dos casos foram detectados apenas por CMA. Os restantes 49% dos casos foram detectados tanto pela CMA como pela análise cromossômica.
A detecção do mosaicismo pela CMA e aquela pela análise cromossômica diferem devido à diferença na tecnologia e na população celular analisada. A CMA analisa o DNA extraído de todas as células nucleadas no sangue periférico, incluindo múltiplas linhagens celulares. Em contraste, a análise cromossômica é realizada principalmente em linfócitos T estimulados pela fitohemaglutinina. Estudos demonstraram que a CMA pode ser mais sensível quando células anormais não respondem a mitógenos e/ou anormalidades são raras ou ausentes em células T, como na síndrome de Pallister-Killian.5,6 Cinco casos de trissomia do mosaico, envolvendo os cromossomos 8, 9, 14 e 22, foram detectados apenas por CMA.
Embora o CMA possa detectar facilmente mosaicismo em níveis de 30% ou maiores, ele é limitado na detecção rotineira de mosaicismo em níveis de <10%.6,13,14 Outras plataformas de array, como as matrizes de polimorfismo de nucleotídeos simples, podem ser mais capazes de detectar o mosaicismo pelas informações obtidas a partir das freqüências do alelo B.15,16 A análise cromossómica pode detectar mosaicismo de baixo nível através do exame individual de um grande número de células. Estudos cromossómicos padrão de 20 células irão excluir 14% de mosaicismo ao nível de 95% de confiança. Mais células podem ser examinadas quando uma ou duas células anormais em metafase são identificadas. Entretanto, a análise de muitas células individuais é demorada e trabalhosa. Se houver suspeita ou confirmação de mosaicismo, FISH pode ser utilizado para examinar centenas de células interfásicas individuais para determinar o nível de mosaicismo; FISH é relativamente menos demorado que a análise cromossômica.
As anormalidades perdidas pela CMA, excluindo os rearranjos aparentemente equilibrados, são responsáveis por <0,2% do total de casos neste estudo ( Tabela 2 ). A maioria dos casos foi indetectável pela CMA porque a proporção de células anormais estava abaixo do limite de detecção de CMA (<10%). O significado clínico não é claro para o mosaicismo de nível muito baixo nos casos 2 e 3, e para o pequeno cromossoma marcador que contém exclusivamente sequências de repetição pericentroméricas no caso 4. As restantes anomalias não detectadas pela CMA estão associadas a anomalias fenotípicas. Não está claro porque a anormalidade observada em 30% das células cultivadas no caso 5 foi perdida pela CMA, mas presumivelmente deve-se ao fato de as células anormais estarem sobre-representadas especificamente nas células T. A presença de duas linhas celulares diferentes com ganhos e perdas genômicas envolvendo a mesma região levou a um balanço genômico líquido para aquela região, fugindo assim à detecção por CMA, como mostrado no caso 6.
Detecção do mosaicismo por CMA se baseia no desvio dos log ratios esperados para deleção ou duplicação sem mosaicismo. A suspeita de mosaicismo tem de ser confirmada pela análise cromossómica em células cultivadas ou análise FISH, de preferência utilizando esfregaços de sangue. Em 11 casos estudados aqui, o CMA foi capaz de detectar a anormalidade cromossômica, mas não foi capaz de detectar que o caso era mosaico devido a uma baixa porcentagem de células normais ou a presença de um cromossomo isodicêntrico levando à tetrassomia segmentar. Por exemplo, dois casos tiveram um ganho de número de cópias detectado por todas as sondas para o cromossomo 18 por CMA ( Figura 2 ), sugerindo a trissomia do cromossomo 18. Na realidade, a análise cromossômica mostrou que um caso tinha trissomia do cromossomo 18 em todas as células ( Figura 2a ), enquanto que o outro caso tinha mosaicismo para trissomia do cromossomo 18 em 80% das células ( Figura 2b ). Além disso, quando duas ou mais linhas celulares anormais envolvem a mesma região, como exemplificado no caso da Figura 2c , a análise cromossômica e/ou FISH é essencial para uma interpretação correta das anormalidades cromossômicas.
A informação estrutural cromossômica é fornecida pela análise cromossômica, mas não aparente pela CMA
CMA fornece informação muito confiável sobre se os ganhos e perdas do número de cópias estão presentes, mas não fornece informação posicional ou de orientação. Nossos estudos mostraram que anormalidades estruturais foram observadas em 18% dos casos de CMA anormais. Metade dos rearranjos estruturais identificados neste estudo são translocações/inserções desequilibradas, um terço são outras alterações estruturais tais como cromossomas anelares, cromossomas marcadores, isocromossomas e cromossomas isodicêntricos, e os restantes 15% são rearranjos complexos. Dado que a maioria dessas aberrações estruturais envolve regiões subteloméricas, as alterações no número de cópias terminais têm maior probabilidade de ter outras anormalidades estruturais.17 Em geral, tanto a análise cromossômica quanto a análise FISH são capazes de identificar translocações, inserções, isocromossomos e marcadores, com diferentes forças para cada método. Embora FISH possa detectar alterações muito pequenas para serem detectáveis pela análise cromossômica, a análise dos padrões de bandagem cromossômica fornece informações adicionais sobre as regiões envolvidas. No caso de rearranjos complexos, a análise combinada de FISH e cromossomas pode ser necessária para determinar completamente as mudanças estruturais complexas. Com esta exceção, a análise FISH após um achado anormal por CMA é tipicamente adequada para fornecer informações sobre a natureza da mudança do número de cópias.
Alguns rearranjos cromossômicos podem falhar mesmo após CMA e FISH. Por exemplo, uma eliminação intersticial em 2q foi detectada pela CMA no caso 9 ( Figura 1a ). Sem a análise cromossômica, o rearranjo parece ser uma simples deleção, mesmo após a análise FISH confirmatória. Entretanto, o exame do cariótipo mostrou um cromossomo 2 anormal com inserção de um segmento de 17q23.1q23.3 na banda 2p11.2. Além disso, o cromossoma 2 com o segmento 17q inserido também tem uma inversão pericêntrica entre 2p12 e 2q31.1. A eliminação no 2q31.1 detectada pela CMA ocorreu muito provavelmente no ou próximo do ponto de quebra da inversão no braço longo de um cromossoma 2. Em resumo, o caso 9 teve um rearranjo complexo incluindo uma deleção em 2q detectável pela CMA mas não visível pela análise cromossômica, assim como uma inserção e uma inversão envolvendo os cromossomos 2 e 17, detectável pela análise cromossômica mas não pela CMA. Da mesma forma, o caso 10 teve de novo rearranjos envolvendo quatro cromossomos, incluindo uma inserção do segmento 2q14.2q24.1 no braço curto de um cromossomo 6, que também tem uma inversão paracêntrica, e uma translocação recíproca entre os cromossomos 12 e 18. As perdas de número de cópias foram identificadas pela CMA perto dos pontos de quebra nos cromossomos 2 e 6 ( Figura 1b ). Um diagnóstico correto requer a combinação de CMA e análise cromossômica.18
Identificação de rearranjos estruturais cromossômicos é indispensável para o aconselhamento genético da família. Os desequilíbrios genéticos detectados pela CMA podem ser devidos a um produto de segregação desequilibrada de uma translocação ou inserção equilibrada em um dos pais e, portanto, justificam uma forte recomendação para a realização de estudos parentais. Além disso, as informações estruturais cromossômicas fornecem um guia para o qual os estudos parentais devem ser recomendados. Para os rearranjos que provavelmente serão produtos de um rearranjo equilibrado, a análise parental FISH ou cromossômica deve ser realizada ao invés da análise parental CMA.
Rearranjos aparentemente equilibrados com um estudo CMA normal
Neste estudo, translocações ou inversões aparentemente equilibradas sem outras anormalidades cromossômicas foram detectadas em 30 casos (~0,8%) pela análise cromossômica. Foi relatado que ~40% dos pacientes com múltiplas anomalias congênitas/ retardo mental e uma translocação de novo aparentemente equilibrada têm anormalidades crípticas próximas aos pontos de ruptura, ou não relacionadas aos pontos de ruptura, que podem ser facilmente detectadas pela CMA.19,20 No entanto, a CMA não detectou nenhuma alteração no número de cópias próximas aos pontos de ruptura nesses 30 casos. Vários fatores podem contribuir para esta observação. A maioria dos rearranjos foi herdada com base nos estudos parentais de um subconjunto dos casos, o que significa que é mais provável que eles sejam “verdadeiramente” equilibrados. Além disso, as translocações Robertsonian, que geralmente não resultam em mudanças no número de cópias de eucromatina, foram incluídas neste estudo, mas excluídas nos estudos publicados. Além disso, pequenas deleções/duplicações crípticas adjacentes aos pontos de quebra podem não ser percebidas porque as matrizes usadas para a maioria desses casos foram direcionadas e não tiveram resolução genômica suficiente para detectar um desequilíbrio.
Embora a maioria dos rearranjos balanceados sejam benignos, os rearranjos de novo estão associados a um maior risco de doença devido a uma deleção críptica ou duplicação, disrupção gênica ou de realce, efeitos de posição, ou efeito epigenético. O risco de ter uma grave anomalia congênita para translocações e inversões recíprocas de novo é de 6,7%.21 Espera-se que o risco seja menor para os casos com CMA normal usando uma matriz de genoma inteiro. Portanto, os rearranjos simples e equilibrados detectados neste estudo têm menor probabilidade de serem a causa dos fenótipos dos pacientes.
Para determinar se e quando a análise cromossômica deve ser realizada para o diagnóstico clínico de anomalias cromossômicas, examinamos os resultados dos casos estudados simultaneamente pela CMA e pela análise cromossômica. Anormalidades cromossômicas detectadas pela análise cromossômica, mas completamente perdidas pela CMA, foram observadas em ~1% dos casos, incluindo rearranjos aparentemente equilibrados em 0,8% dos casos e desequilíbrios associados ao mosaicismo em 0,16% dos casos. Além disso, a análise cromossômica facilitou a detecção de rearranjos estruturais cromossômicos em 18% dos casos com resultados anormais de CMA.
Embora a CMA forneça informações sobre variação do número de cópias e mosaicismo, apenas a análise cromossômica ou FISH fornece as informações estruturais cromossômicas associadas a essas alterações do número de cópias e identifica alguns casos de mosaicismo não detectados pela CMA. As vantagens do FISH sobre a análise cromossômica é que pequenas (<3-10 Mb) alterações do número de cópias podem ser detectadas e um grande número de núcleos pode ser rapidamente analisado, o que é especialmente útil para a avaliação do mosaicismo. Portanto, após uma CMA anormal, a análise FISH pode ser aplicada primeiro para detectar rearranjos estruturais associados a alterações do número de cópias e confirmar o mosaicismo e determinar a percentagem de células anormais. Quando inserções ou translocações são detectadas por FISH, a análise cromossômica pode ser indicada para determinar os cromossomos envolvidos. Ao invés da análise cromossômica padrão, que estuda 20 células metafásicas de duas culturas, uma análise cromossômica em pequena escala de cinco células de uma cultura é suficiente para este propósito. Essa estratégia detectaria todas as mudanças estruturais, exceto por alguns raros rearranjos complexos.
Para casos com resultado normal pela CMA, uma análise cromossômica completa pode ser considerada se o paciente tiver múltiplas anomalias congênitas, características dismórficas e/ou retardo mental que lembrem uma síndrome cromossômica ou manifestações clínicas indicativas de potencial mosaicismo, tais como anormalidades pigmentares distribuídas aleatoriamente ou que seguem as linhas de Blashko e assimetria de crescimento em associação com deficiência intelectual. Com base neste estudo, ~1% dos casos teriam resultados cromossômicos informativos, mas <0,001 dos casos (3/3.710) teria um achado clinicamente significativo.
Em resumo, nosso estudo confirma ainda que quase todas as anormalidades cromossômicas detectáveis pela análise cromossômica são detectadas pela CMA, apoiando a recomendação de que a CMA seja o teste de primeiro nível. Entretanto, a análise citogenética tradicional permanece útil para a detecção do mosaicismo e caracterização de rearranjos estruturais.