Charakterizace protizánětlivého Lactobacillus reuteri BM36301 a jeho probiotické účinky na stárnoucí myši

Charakterizace probiotických bakterií mléčného kvašení

Bakterie mléčného kvašení (LAB) izolujeme již řadu let z různých zdrojů včetně lidí, zvířat, rostlin a potravin. Tyto sbírky mikroorganismů Benebios (BM) se skládají z více než 500 kmenů, jejichž probiotický potenciál byl odhalen na základě jejich prvotního screeningu. V této studii jsme vybrali čtyři lidské komenzální kmeny získané ze vzorků fekálií a dále je podrobně studovali (tabulka 1). Konkrétně byly zkoumány dva kmeny Lactobacillus reuteri (BM36301 a BM36304), kmen L. gasseri (BM33601) a kmen Bifidobacterium animalis subsp. lactis (BM10307).

Bakterie jsme zkoumali z hlediska jejich obecné kvalifikace jako probiotik (tabulka 1). Za prvé, tyto kmeny BM vykazovaly odolnost vůči kyselinám (pH 2,5) a žlučovým solím (0,3 %) a vykazovaly rozmezí 43 % až 98,5 % míry přežití po 1 hodině ošetření při 37 °C, což jsou poměrně vysoké výsledky . Dále jsme testovali antimikrobiální aktivity proti střevním bakteriím. Zatímco L. gasseri BM33601 vykazoval minimální inhibici testovaného kmene E. coli, všechny ostatní tvořily výrazné inhibiční zóny (vzdálenost 0,5-3 mm od okrajů LAB). Tyto inhibiční účinky jsou obvykle způsobeny bakteriociny, organickými kyselinami (kyselina mléčná nebo octová), peroxidem vodíku nebo ethanolem z LAB . Nakonec jsme se zabývali jejich schopností vázat se na lidské střevní epiteliální buňky (IEC) in vitro. Za tímto účelem jsme kultivovali lidské buňky rakoviny tlustého střeva HT-29 na krycích sklíčkách po dobu 15 dnů a aplikovali na ně živé kultury LAB po dobu 1 h (Metody). Po rozsáhlém promytí byly zbývající bakteriální buňky vizualizovány barvením podle Grama pro počítání pod mikroskopem . Kmeny L. reuteri BM36301 a BM36304 vykazovaly vysoké skóre retence (5,5-7,4 bakterií na HT-29), zatímco L. gasseri BM33601 střední (1,7 bakterií na HT-29) a B. animalis subsp. lactis BM10307 nízké (0,3 bakterií na HT-29) skóre. Silnější adheze LAB k IEC je obzvláště důležitá, protože musí zůstat ve vrstvě střevní sliznice dostatečně dlouho, aby se projevil jejich přínos pro hostitele . Z těchto primárních experimentů vyplynul vyšší potenciál dvou kmenů L. reuteri jako kvalitních probiotik.

Regulace produkce TNF-α bakteriemi mléčného kvašení in vitro

Zaměřili jsme se na screening LAB z hlediska jejich potenciálu potlačovat střevní zánět. Za tímto účelem jsme upravili systém tkáňových kultur in vitro, kde lidské myeloidní buňky (THP-1) vylučují TNF-α po aktivaci jejich receptorů podobných Toll (TLR) bakteriálním lipopolysacharidem (LPS) . Nejprve jsme ověřili, že THP-1 buňky v počtu 5 × 104 v 1 ml kultury ošetřené LPS v dávce 150 ng/ml po dobu 3,5 h obvykle vedou k produkci 200-300 pg/ml TNF-α (obr. 1a, dráhy 1 a 2). Poté jsme odebrali supernatanty bakteriálních kultur kultivovaných po dobu 24 h, vakuově je vysušili a rekonstituovali kondicionované médium (CM) (Metody). Toto CM obsahuje komplex aktivit k potlačení i indukci TNF-α v závislosti na LAB a kultivačních podmínkách . Skutečně jsme pozorovali mírnou produkci TNF-α CM z BM36304 a BM36301 bez LPS, ale toto množství bylo menší než 20 % indukce stimulované LPS (údaje nejsou uvedeny). Nakonec jsme ke každé CM přidali až 5 % kultury THP-1 (v/v) v přítomnosti LPS (obr. 1a, dráhy 3-6). Produkce TNF-α s LPS (208 ± 49 pg/ml, pruh 2) byla potlačena na 40 % s CM z L. reuteri BM36301 (90,90 ± 49,3 pg/ml, pruh 3) a na 52 % s CM z B. animalis subsp. lactis BM10307 (118,8 ± 19,0 pg/ml, pruh 6). Pro účely našeho screeningu jsme za protizánětlivé považovali potlačení exprese TNF-α blízké nebo menší než 50 % při působení LPS. CM z L. reuteri BM36304 a L. gasseri BM33601 však nebyly schopny potlačit produkci TNF-α do této míry. Tuto inertní aktivitu jsme ověřili přípravou těchto CM za různých kultivačních podmínek (údaje nejsou uvedeny).

Dále jsme zkoumali schopnost indukce TNF-α samotnými bakteriálními buňkami, protože buněčné složky grampozitivních bakterií mohou vyvolávat zánětlivé reakce . Za tímto účelem jsme bakterie vypěstovali do exponenciální fáze (16 h), poté jsme tyto živé bakteriální buňky sklidili, promyli a přidali v nadbytku (250násobný počet buněk) ke kultuře THP-1 . Metabolické aktivity bakteriálních buněk byly udržovány na minimální úrovni pomocí antibiotik přidaných do média THP-1. Po 6 hodinách inkubace byl kvantitativně změřen vylučovaný TNF-α (obr. 1b). Přestože bylo zjištěno, že všechny čtyři LAB buňky indukují TNF-α, BM36301 produkoval výrazně menší množství (609 pg/ml) než ostatní: BM36304 (2342 pg/ml), BM33601 (3100 pg/ml) a BM10307 (7141 pg/ml). Během této 6hodinové koinkubace jsme pozorovali, že u buněk THP-1 došlo k variabilní buněčné smrti v závislosti na použitém LAB (Additional file 1). Především BM36301, nejnižší induktor TNF-α, způsobil nejmenší množství smrti THP-1 (9,7 %), zatímco ostatní kmeny indukující vyšší TNF-α způsobily výrazně výraznější smrt (24-38 %). Není to tedy tak, že by BM36301 indukoval nízkou hladinu TNF-α v důsledku ztráty životaschopnosti THP-1 jako takové. Pro účely našeho screeningu jsme LAB s aktivní produkcí TNF-α vyšší než 1000 pg/ml považovali za prozánětlivé.

Shrnuto, imunomodulační aktivity in vitro byly přiřazeny jako protizánětlivé u supresivních CM (BM36301 a BM10307) a prozánětlivé u indukujících živých buněk (BM36304, BM33601 a BM10307). Protože BM10307 vykazoval obě aktivity, přiřadili jsme mu duální funkčnost (obr. 1c). Zajímavé bylo, že oba kmeny L. reuteri vykazovaly odlišné aktivity. Z počátečního screeningu naší široké škály sbírek BM se ukázalo, že protizánětlivé kmeny jsou spíše vzácné, s mírou objevení menší než 5 % (údaje nejsou uvedeny). Také některé kmeny nevykazovaly ani jednu aktivitu a spadaly tak do kategorie „neutrálních“ (údaje nejsou uvedeny).

Supresivní molekuly v KM jsou stabilní vůči teplu a trypsinu

Protože se KM z LAB skládají z různých bakteriálních metabolitů i buněčných složek, snažili jsme se lépe porozumět protizánětlivé povaze KM. Exprese TNF-α se kvantitativně snižovala se zvyšující se koncentrací CM z L. reuteri BM36301 (obr. 2a) a B. animalis subsp. lactis BM10307 (obr. 2b). Zajímavé je, že menší množství CM z BM36301 (0,5× vstupní nebo 2,5 % v/v) skutečně dále indukovalo TNF-α, což odpovídá pozorování, že tato CM do určité míry obsahuje materiály indukující TNF-α (obr. 2a, dráhy 2 a 3). Nicméně potlačující účinky se staly dominantními při vyšším množství CM, což naznačuje, že protizánětlivé materiály jsou kvantitativně aditivní a že odpovídající receptory na povrchu buněk THP-1 jsou dostatečně početné, aby snadno reagovaly na zvyšující se množství CM. Celkově tato pozorování naznačují, že CM obsahují aktivní metabolity odpovědné za potlačení TNF-α, a to i přes jejich komplexní povahu.

Dále jsme zkoumali fyzikálně-chemické vlastnosti protizánětlivých látek v CM. Bylo zjištěno, že vaření CMs z každého kmene po dobu 10 min je neúčinné při změně jejich TNF-α inhibiční funkce ve srovnání s nativními CMs (obr. 2c, dráhy 3 a 4). Stejně tak ošetření trypsinem neovlivnilo jejich aktivitu (obr. 2c, dráha 5). Tato pozorování naznačují, že hlavními inhibičními faktory v těchto CM nejsou ani proteiny, ani molekuly citlivé na teplo.

Regulace TNF-α u myší pomocí probiotických bakterií

Konečnou otázkou s ohledem na regulaci TNF-α in vitro na základě našeho screeningu LAB bylo, jak relevantní bude s aplikacemi in vivo. Na tuto otázku jsme se snažili odpovědět přímo aplikací vybraných kmenů L. reuteri na myší modelový systém. Připravili jsme 20týdenní inbrední myši C57BL/6 po 6 samcích a 8 samicích v každé skupině. Poté byla po dobu 20 týdnů jedna skupina léčena protizánětlivým kmenem BM36301, druhá skupina byla léčena prozánětlivým kmenem BM36304 a kontrolní skupina byla léčena dextrózou (Metody). Aby se minimalizovalo utrpení zvířat, byly kultury LAB podávány prostřednictvím pitné vody tak, aby byla splněna denní spotřební dávka 1 × 106 bakterií na myš. Poskytovali jsme také standardní stravu, aby proces stárnutí probíhal během tohoto období přirozeně. Na konci 20týdenní inkubace (celkem 40 týdnů stáří) jsme myši eutanazovali a odebrali krev pro přípravu séra na měření cytokinů a testosteronu pomocí kvantitativních metod ELISA. Po provedení nekropsie jsme nezjistili žádné hrubé morfologické abnormality.

V souhrnu jsme pozorovali snížení sérového TNF-α protizánětlivým přípravkem BM36301, přičemž výraznější účinek byl pozorován u samic. Prozánětlivý BM36304 vedl ke zvýšení TNF-α u mužů, ale ne u žen. Tato zjištění naznačují, že náš screening in vitro nese smysluplný význam s udržením TNF-α in vivo v těchto pokusech na myších.

L. reuteri BM36301 udržuje snížený přírůstek tělesné hmotnosti a vysokou hladinu testosteronu u myších samců

Stárnutí je zdrojem mnoha zdravotních problémů u lidí, včetně cukrovky a obezity. K prohloubení těchto problémů se stárnutím se na zvířecím modelu často používají diety s vysokým obsahem tuku . Interpretace na těchto zrychlených pokusech však může být komplikovaná, protože žádné stárnutí u lidí by nemělo být způsobeno účelovou dietou s vysokým obsahem tuku. Všechny myši jsme pěstovali se standardní stravou, aby proces jejich stárnutí mohl být co nejpřirozenější. V časovém rozmezí 20 týdnů experimentu, počínaje věkem 20 týdnů, přibrali samci kontrolní skupiny na hmotnosti přibližně 8 g (7,83 ± 1,2 g) a samice kontrolní skupiny na hmotnosti přibližně 5 g (4,8 ± 0,94 g). Pozoruhodné bylo, že přírůstek hmotnosti u samců krmených protizánětlivým přípravkem BM36301 byl významně nižší než u kontroly (5,78 ± 0,75 g, p = 0,040), a to o 36 % (obr. 4a, dráhy 1 a 2). Přírůstek hmotnosti samců krmených BM36304 (7,53 ± 0,74 g) se však od kontroly významně nelišil (p = 0,67). Hmotnostní přírůstky samic ve skupinách se od sebe statisticky nelišily.

Dalším významným rozdílem byla hladina inzulinu v séru samců léčených přípravkem BM36304 (obr. 4b). Zatímco kontrolní skupina mužů vykazovala 3,18 ± 0,65 ng/ml inzulinu, skupina mužů krmených BM36304 vykazovala 4,91 ± 0,63 ng/ml inzulinu (p = 0,027). V souladu se zjištěním, že přírůstek hmotnosti u této skupiny se příliš nelišil od kontrolní skupiny (obr. 4a), jsme však u mužů krmených BM36304 nepozorovali výraznější akumulaci abdominálního tuku (údaje nejsou uvedeny). Ve věku 40 týdnů nemusel inzulinový výkyv u myší způsobit klinicky zjevný diabetes, ale onemocnění se mohlo projevit výrazněji, pokud myši dále stárly. Variabilita inzulinu mezi skupinami samic se od sebe významně nelišila.

Nakonec jsme se zaměřili na hladiny testosteronu u samců. Jak ukazuje obr. 4c, samci krmeni protizánětlivým BM36301 si zachovali významně vyšší hladiny testosteronu v séru (5,18 ± 0,87 ng/ml) než kontrolní skupina (2,20 ± 0,38 ng/ml, p = 0,0025). Skupina léčená BM36304 se však statisticky nelišila (3,23 ± 2,10 ng/ml, p = 0,07) od kontrolní skupiny. Abychom lépe porozuměli výsledkům měření testosteronu, vyšetřili jsme varlata každé myši. Hmotnost párových varlat samců krmených BM36301 byla 0,579 ± 0,075 g, tedy o 10 % vyšší než u kontrolní skupiny (0,525 ± 0,05 g, p = 0,049). Vzhledem k menšímu přírůstku hmotnosti ve skupině BM36301 (obr. 4a) je tento rozdíl ve velikosti varlat ještě patrnější; poměr hmotnosti varlat k přírůstku tělesné hmotnosti (TW/WG) kontrolní skupiny byl pouze 67 % hmotnosti skupiny BM36301. Mikroskopické rozdíly tkání z varlat, jako je průměr semenných kanálků, jsme však mezi těmito dvěma skupinami nepozorovali (156,03 ± 6,65 μm u kontroly vs. 153,95 ± 18,66 μm u samců léčených BM36301, p = 0,51). Další studie, jako je porovnání spermatogeneze nebo plochy Leydigových buněk, jsme neprováděli.

Shrnem lze říci, že protizánětlivý přípravek BM36301 pomohl samcům udržet nižší přírůstek hmotnosti s většími varlaty a větším množstvím testosteronu ve stáří. Snížená produkce testosteronu u stárnoucích mužů byla navržena v souvislosti s věkově závislými změnami ve varlatech, pravděpodobně v důsledku zánětlivé inzultace . Mezitím prozánětlivý BM36304 vyvolal zvýšení inzulínu, i když bez změn v přírůstku hmotnosti nebo testosteronu u mužů. Pozoruhodné je, že žádný z těchto bakteriálních kmenů neměl významný vliv na tyto tělesné míry u myších samic.

Zdravá kůže samic z protizánětlivého BM36301

Jednou ze zajímavých vlastností některých probiotik je, že mohou podporovat zdraví kůže způsobem závislým na regulaci imunity . Vzhledem k tomu, že kmen BM36301 vykazoval také protizánětlivé účinky in vitro a in vivo, položili jsme si otázku, zda tento kmen může vyvolat takovéto zdraví prospěšné účinky na kůži. V 18. týdnu léčby jsme oholili oblast na 2 myších z každé skupiny a po 1 týdnu jsme je vyšetřili. Je zajímavé, že myší samice krmené kmenem BM36301 vykazovaly na oholeném místě rychlejší opětovný růst srsti, i když ne úplnou obnovu (obr. 5a). Naproti tomu kontrolní skupiny nebo skupiny s BM36304 nevykazovaly tak rychlou obnovu. U žádného z léčených samců nebyl opětovný růst chlupů zřetelně rychlejší než u kontroly, což naznačuje, že tento zrychlený růst chlupů může být zřejmý pouze u samic. Dalším měřítkem pro hodnocení zdraví kůže je zkoumání lesklosti srsti. Smyslovým měřením ani měřením světelným metrem jsme však nezaznamenali významné rozdíly mezi jednotlivými skupinami, a to především kvůli poměrně lesklému stavu srsti kontrol (data nejsou uvedena).

Další hodnocení stavu kůže jsme provedli zkoumáním příčných řezů kůže pod mikroskopem po obarvení Hematoxylinem a Eosinem. Jak je znázorněno na obr. 5b a c, zjistili jsme, že myší samice léčené přípravkem BM36301 vykazovaly vyšší počet podkožních vlasových folikulů (HF) než kontrolní myší samice. Počet HF na jeden mikroskopický pohled při rozlišení 400× byl u kontrolní skupiny samic 3,50 ± 0,52, zatímco u samic krmených přípravkem BM36301 byl počet 4,80 ± 0,61 s významným rozdílem (p = 0,023). Samice léčené BM36304 však vykazovaly pouze mírnou změnu (4,15 ± 1,73, p = 0,55 oproti kontrolní skupině). Při podrobnější analýze vlasových folikulů jsme zjistili, že samice krmené BM36301 vykazovaly nepatrně aktivnější fáze vlasového cyklu než kontrola (anagen + katagen: telogen byl 81:19 u kontroly vs. 95:5 u samic krmených BM36301). Zatímco počty HF ze skupin samců se od sebe příliš nelišily (obr. 5b). Nakonec jsme hodnotili také tloušťku kůže měřenou jako hloubku od epidermis k panniculus carnosus (obr. 5c, doplňkový soubor 1). Mezi kontrolními samicemi a samicemi léčenými přípravkem BM36301 jsme nezjistili velký rozdíl v hloubce. Kožní vrstvy u myší krmených BM36301 se však ukázaly být nepatrně hlubší než u kontrol a tuková tkáň u myší krmených BM36301 byla mělčí než u kontrol. Většina podkožních HF se nacházela v dermis.

Obecně tato pozorování naznačují, že léčba protizánětlivým přípravkem BM36301 podpořila zdravější kůži, což se projevilo opětovným růstem srsti a počtem HF u samic. Mikroskopické rozdíly vzorků kůže mezi kontrolní a BM36301 skupinou se však jevily spíše jako marginální. Tyto přínosy pro zdraví kůže nebyly pozorovány u mužů. Také prozánětlivý BM36304 neměl v době pokusů na kůži žádné nepříznivé účinky.