B. Epitopy B-buněk
Omezujeme se na epitopy B-buněk na proteinech a peptidech; epitopy na jiných biopolymerech a haptenových skupinách se nezabýváme. První důležité zobecnění o epitopech B-buněk je, že jsou namířeny proti trojrozměrným vlastnostem molekulárního povrchu proteinů a polypeptidů. Zvláštní trojrozměrná topologie je charakteristickým znakem epitopů B-buněk na rozdíl od epitopů T-buněk. Je pravděpodobné, že jakýkoli aminokyselinový zbytek přístupný z povrchu proteinu může být součástí jednoho nebo druhého epitopu B-buněk (Benjamin et al., 1984). Proto mohou proteiny obsahovat velmi mnoho různých epitopů, ačkoli se na antigen může ze sterických důvodů vázat vždy jen omezený počet protilátek. Reakce B-buněk je stereospecifická a je mnohem slabší proti d-enantiomerům peptidů (Gill et al., 1963) a proteinů (Dintzis et al., 1993), pravděpodobně proto, že d-enantiomerní proteiny nejsou účinně zpracovávány za vzniku peptidů pro pomoc T-buněk.
Dříve se předpokládalo, že proteiny mají dobře definovanou antigenní strukturu charakterizovanou omezeným počtem epitopů. Poznatky o komplexní povaze imunitní odpovědi B-buněk a její regulaci a o specifičnosti monoklonálních protilátek proti proteinům jasně ukázaly, že protein nemá definovanou antigenní strukturu. V rozporu s tvrzením některých badatelů (Atassi a Lee, 1978; Atassi, 1984) není možné definovat „úplnou antigenní strukturu“ proteinu. Antigenicita proteinu je jak vlastností topografie proteinu, tak regulačních mechanismů hostitelského imunitního systému, včetně tolerance ke strukturám podobným vlastním proteinům hostitele, specifičnosti pomoci T-buněk a idiotypových sítí (Benjamin et al., 1984; Berzofsky, 1985). Imunodominantní místa, tj. místa, na která je namířena většina, ale ne všechny protilátky imunitní odpovědi, nejsou vnitřní vlastností proteinu per se. Jak již dříve upozornili jiní, epitopy neexistují samy o sobě, ale pouze na základě spojení s komplementárním vazebným místem protilátky, tzv. paratopem (Berzofsky, 1985; Van Regenmortel, 1986, 1989). Epitop je tedy relační pojem a definice epitopu je nutně operační (Van Regenmortel, 1986). Jinými slovy, definice konkrétního epitopu závisí do značné míry na molekulární geometrii a chemické povaze příslušného paratopu a, což je možná ještě důležitější, na experimentálním přístupu zvoleném k mapování epitopu.
Tento stav lze ilustrovat na příkladu prvního komplexu protein-protilátka, jehož struktura byla vyřešena pomocí rentgenové krystalografie (Amit et al., 1986). V tomto komplexu se 16 zbytků lysozymu dotýká 17 zbytků monoklonálního Fab (fragmentu protilátky) proti lysozymu. Epitop se rozprostírá na 750 Å2 povrchu lysozymu. Naproti tomu mapování epitopů s řadou sekvenčně příbuzných ptačích lysozymů ukazuje, že pro vazbu lysozymu na monoklonální protilátky proti lysozymu je důležitých pouze několik zbytků. Mutace jen několika málo zbytků může radikálně snížit asociační konstantu komplexu lysozymu a protilátky (Harper et al., 1987). V jednom případě jediná záměna Arg za Lys snížila afinitu lysozymu k monoklonální protilátce o dva řády (Smith-Gill et al., 1982). Teoretické výpočty založené na krystalových strukturách dvou komplexů lysozymu s fragmenty Fab ukázaly, že z mnoha zbytků, které definují epitop v krystalu, pouze několik skutečně přispívá ke stabilitě komplexu (Novotny et al., 1989). Na základě svých výpočtů Novotny a spol. rozlišili mezi energetickým a pasivním epitopem. Energetický epitop zahrnuje ta rezidua, která přispívají k energetice vazby. Pasivní epitop poskytuje pouze povrchovou komplementaritu kolem zbytků, které tvoří energetický epitop. To, že pouze několik interakcí viditelných v krystalové struktuře hraje hlavní roli při stabilizaci komplexu antigen-protilátka, bylo potvrzeno u vazby neuraminidázy chřipkového viru na monoklonální protilátku. Devatenáct zbytků neuraminidázy se v krystalu dotýká 17 zbytků protilátky, ale místně specifická mutace pouze 3 zbytků vazbu zcela zruší (Air et al., 1990; Nuss et al., 1993).
Obecněji použitelné operační rozlišení epitopů je rozlišení mezi kontaktním a funkčním epitopem. Kontaktní epitop se vztahuje k informacím získaným z trojrozměrné struktury komplexu antigen-protilátka; funkční epitop se vztahuje k informacím z nekrystalografických mapovacích postupů, včetně mapování epitopů s peptidy. Kontaktní epitop je reprezentován shodou velkých komplementárních povrchových ploch antigenu a protilátky, jak je vidět v několika rentgenových strukturách komplexů protein-protilátka (Davies a Padlan, 1990; Wilson a Stanfield, 1994; Braden a Poljak, 1995). Kontaktní epitopy pokrývají několik stovek čtverečních angströmů molekulárního povrchu. Funkční epitop definuje zbytky, které se zdají být významné pro vazbu protilátky a jejichž mutace může snížit nebo zcela zrušit vazbu. Funkční epitop může obsahovat pouze 2 až 3 zbytky, jako je tomu u výše uvedených příkladů lysozymu a neuraminidázy. Z funkčního epitopu nelze odvodit kontaktní epitop. Stejně tak kontaktní epitop sám o sobě neodhaluje funkční epitop. Na straně protilátky lze také rozlišit dva typy paratopů: funkční paratop a kontaktní paratop. To vyplývá z termodynamické analýzy oblastí určujících komplementaritu monoklonální protilátky (Kelley a O’Connell, 1993).
Dvojí povaha epitopu, jak ji odhalují krystalografické a nekrystalografické mapovací techniky, odráží dva různé modely molekulárního rozpoznávání. Takto nahlíženo se obtíž při definování povahy epitopů posouvá na úroveň epistemologické obtíže: jak máme modelovat realitu pomocí omezených experimentálních prostředků, které máme k dispozici? Tato omezení budeme mít na paměti při diskusi o mapování epitopů pomocí peptidů.
Zde musíme zmínit dlouho známou koncepční klasifikaci epitopů B-buněk na sekvenční a konformační (Sela a kol., 1967; Sela, 1969; Atassi a Smith, 1978). Epitop se nazývá sekvenční nebo kontinuální, pokud jej lze reprezentovat řadou sousedících zbytků polypeptidového řetězce. O protilátce se říká, že rozpoznává sekvenční epitop, pokud reaguje s krátkým, flexibilním peptidem nebo s denaturovaným, rozloženým polypeptidovým řetězcem. Konformační epitop, nazývaný také diskontinuální nebo topografický nebo sestavený, je sestaven z nesouvislých částí sekvence aminokyselin skládáním polypeptidového řetězce v nativním proteinu. O protilátce se říká, že rozpoznává konformační epitop, pokud reaguje s nativním proteinem, a nikoli s rozloženým polypeptidovým řetězcem, nebo pokud reaguje s peptidem jedinečné konformace, například šroubovicí, ale nikoli s peptidem s náhodnou spirálou.
Rozlišování mezi sekvenčními a konformačními epitopy je poněkud arbitrární a může být zavádějící. Protože každý paratop má přesně definovanou trojrozměrnou strukturu, interakce mezi paratopem a epitopem je vždy souladem struktur v trojrozměrném prostoru. To platí jak pro epitop na dobře uspořádaném globulárním proteinu, tak pro epitop na krátkém flexibilním peptidu. V druhém případě musí peptid při vazbě na protilátku také zaujmout jedinečnou konformaci; proto je souvislý epitop také „konformační“. Vazebná konformace buď existuje předem, nebo je vyvolána paratopem (viz oddíly V,B a V,C).
V případě protilátek proti nativním proteinům se tvrdí, že většina nebo možná všechny epitopy jsou nespojité (Barlow a kol., 1986). Vzhledem k velké velikosti typického kontaktního epitopu v krystalu antigen-protilátka je skutečně nepravděpodobné, že by se protilátka vázala výhradně na souvislý úsek polypeptidového řetězce a ne také na kontaktní zbytky vzdálené v sekvenci, ale blízké v prostoru. Modely proteinů vyplňující prostor vykazují jen málo lineárních úseků delších než 4 až 5 zbytků v přímé peptidové vazbě přístupných na povrchu molekuly. To neznamená, že protilátka namířená proti sestavenému epitopu na povrchu proteinu nemusí zkříženě reagovat také s peptidem odpovídajícím úseku proteinu.
Závěrem našeho přehledu o povaze epitopů B-buněk ještě jednou zdůrazňujeme samotnou obtížnost podat obecnou definici „epitopu“. Pragmatické uchýlení se k operačním definicím nemusí puristy potěšit, ale operační definice mohou být užitečné při zodpovídání otázek o charakteru konkrétní interakce antigen-protilátka.