Jednoduchý průvodce CRISPR, jedním z největších vědeckých příběhů desetiletí

Jeden z největších a nejdůležitějších vědeckých příběhů posledních několika let bude pravděpodobně také jedním z největších vědeckých příběhů několika příštích let. Proto je právě teď vhodná doba seznámit se s novou výkonnou technologií editace genů známou jako CRISPR.

Pokud jste o CRISPR ještě neslyšeli, stručné vysvětlení zní takto: V posledních devíti letech vědci přišli na to, jak využít zvláštnosti v imunitním systému bakterií k úpravě genů v jiných organismech – rostlinách, myších, dokonce i v lidech. Díky CRISPRu mohou nyní tyto úpravy provádět rychle a levně, v řádu dnů, nikoli týdnů či měsíců. (Tato technologie se často označuje jako CRISPR/Cas9, ale my zůstaneme u CRISPR, což se vyslovuje „crisper“.)

Mluvíme o novém mocném nástroji, který umožňuje kontrolovat, které geny se projeví v rostlinách, zvířatech, a dokonce i u lidí; o schopnosti odstraňovat nežádoucí znaky a případně přidávat znaky žádoucí s větší přesností než kdykoli předtím.

Vědci ji zatím použili ke snížení závažnosti genetické hluchoty u myší, což naznačuje, že by jednou mohla být použita k léčbě stejného typu ztráty sluchu u lidí. Vytvořili houby, které snadno nehnědnou, a upravili buňky kostní dřeně u myší k léčbě srpkovité anémie. V budoucnu by nám CRISPR mohl pomoci vyvinout plodiny odolné vůči suchu a vytvořit nová účinná antibiotika. CRISPR by nám dokonce jednoho dne mohl umožnit vyhubit celé populace komárů šířících malárii nebo vzkřísit kdysi vyhynulé druhy, jako je holub stěhovavý.

Velkou obavou je, že ačkoli je CRISPR relativně jednoduchý a výkonný, není dokonalý. Vědci se nedávno dozvěděli, že tento přístup k úpravě genů může neúmyslně vymazat a přeskupit velké úseky DNA způsobem, který může ohrozit lidské zdraví. To navazuje na nedávné studie, které ukázaly, že buňky upravené pomocí CRISPR mohou neúmyslně vyvolat rakovinu. Proto mnoho vědců tvrdí, že pokusy na lidech jsou předčasné:

V této souvislosti přinesl rok 2018 šokující zprávu: v listopadu oznámil čínský vědec He Jiankui, že vytvořil první lidské děti na světě s geny upravenými pomocí CRISPR: dvojici dvojčat odolných vůči viru HIV.

Toto oznámení ohromilo vědce na celém světě. Ředitel Národního ústavu zdraví Francis Collins prohlásil, že tento experiment je „hluboce znepokojující a pošlapává etické normy“.

Vytvořil také více otázek, než kolik jich zodpověděl: Jiankui to skutečně dokázal? Zaslouží si pochvalu, nebo odsouzení? Je třeba výzkum CRISPR zbrzdit?“

Ačkoli nezávislí vědci zatím nepotvrdili, že byl Jiankui úspěšný, existují další aplikace CRISPR, které jsou blízko realizaci, od nových terapií nemocí až po nové taktiky boje proti malárii. Zde je tedy základní průvodce tím, co je CRISPR a co dokáže.

Co je to vlastně CRISPR?

Chceme-li pochopit CRISPR, měli bychom se vrátit do roku 1987, kdy japonští vědci zkoumající bakterie E. coli poprvé narazili na neobvyklé opakující se sekvence v DNA tohoto organismu. „Biologický význam těchto sekvencí,“ napsali, „není znám“. Postupem času našli další vědci podobné shluky v DNA jiných bakterií (a archeí). Dali těmto sekvencím název: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats – neboli CRISPR.

Přesto byla funkce těchto sekvencí CRISPR většinou záhadou až do roku 2007, kdy potravinářští vědci zkoumající bakterii Streptococcus používanou k výrobě jogurtu ukázali, že tyto zvláštní shluky skutečně plní důležitou funkci:

Bakterie jsou pod neustálým útokem virů, takže produkují enzymy, kterými se brání virovým infekcím. Kdykoli se enzymům bakterie podaří zničit napadající virus, objeví se další malé enzymy, které seberou zbytky genetického kódu viru a rozřežou ho na malé kousky. Enzymy pak tyto fragmenty uloží do míst CRISPR v genomu bakterie.

Teď přijde ta chytrá část: Bakterie využívají genetickou informaci uloženou v těchto prostorech k odvrácení budoucích útoků. Když dojde k nové virové infekci, bakterie vyprodukují speciální útočné enzymy, známé jako Cas9, které tyto uložené kousky virového genetického kódu přenášejí jako fotku. Když tyto enzymy Cas9 narazí na virus, zjistí, zda RNA viru odpovídá tomu, co je na snímku. Pokud se shoduje, enzym Cas9 začne sekat DNA viru, aby hrozbu neutralizoval. Vypadá to trochu takto:

Tak to dělá CRISPR/Cas9. Po nějakou dobu tyto objevy nikoho kromě mikrobiologů příliš nezajímaly – dokud nedošlo k řadě dalších průlomových objevů.

Jak CRISPR způsobil revoluci v úpravě genů?

V roce 2011 si Jennifer Doudna z Kalifornské univerzity v Berkeley a Emmanuelle Charpentier z univerzity ve švédském Umeå lámaly hlavu nad tím, jak systém CRISPR/Cas9 vlastně funguje. Jak se enzym Cas9 shoduje s RNA na snímcích hrnků s RNA ve virech? Jak enzym poznal, kdy má začít sekat?

Vědci brzy zjistili, že mohou protein Cas9 „oklamat“ tím, že mu dodají umělou RNA – falešný snímek. Když to udělali, enzym vyhledal cokoli se stejným kódem, nejen viry, a začal sekat. V přelomové práci z roku 2012 Doudna, Charpentier a Martin Jinek ukázali, že pomocí tohoto systému CRISPR/Cas9 mohou rozsekat jakýkoli genom na libovolném místě.

Ačkoli v té době byla technika demonstrována pouze na molekulách ve zkumavkách, její důsledky byly dechberoucí.

Následovaly další pokroky. Feng Zhang, vědec z Broad Institute v Bostonu, byl v únoru 2013 spoluautorem článku v časopise Science, který ukázal, že CRISPR/Cas9 lze použít k úpravě genomů kultivovaných myších buněk nebo lidských buněk. Ve stejném čísle časopisu Science ukázal George Church z Harvardu a jeho tým, jak lze jinou techniku CRISPR použít k editaci lidských buněk.

Od té doby vědci zjistili, že CRISPR/Cas9 je úžasně univerzální. Vědci mohou pomocí CRISPR nejen „umlčet“ geny tím, že je odstřihnou, ale mohou také využít opravné enzymy k nahrazení požadovaných genů do „díry“ po odstřihovačích (i když tato druhá technika je složitější). Vědci by tak například mohli říci enzymu Cas9, aby odstřihl gen způsobující Huntingtonovu chorobu a vložil místo něj „dobrý“ gen.

Editace genů jako taková není novinkou. Různé techniky vyřazování genů existují již řadu let. To, co dělá CRISPR tak revolučním, je jeho přesnost: Enzym Cas9 se většinou dostane tam, kam mu řeknete. A je to neuvěřitelně levné a snadné: V minulosti by změna genu mohla stát tisíce dolarů a týdny nebo měsíce tahanic. Nyní to může stát jen 75 dolarů a zabere to jen několik hodin. A tato technika funguje na všech organismech, na kterých byla vyzkoušena.

Je to nyní jeden z nejžhavějších oborů. V roce 2011 bylo o CRISPR publikováno méně než 100 článků. V roce 2018 jich bylo více než 17 000 a stále přibývají další, s vylepšeními CRISPR, novými technikami manipulace s geny, zlepšením přesnosti a dalšími. „Stal se z toho tak rychle se rozvíjející obor, že už i já mám problém držet krok,“ říká Doudna. „Dostáváme se do bodu, kdy účinnost editace genů dosahuje úrovně, která bude zjevně užitečná jak z terapeutického hlediska, tak i pro obrovské množství dalších aplikací.“

Probíhá také intenzivní právní bitva o to, kdo přesně by měl získat zásluhy za tuto technologii CRISPR a kdo vlastní potenciálně lukrativní práva. Byla průlomová Doudnova práce z roku 2012 na Kalifornské univerzitě v Berkeley, nebo byl klíčovým pokrokem Zhangův výzkum z roku 2013 na Broad Institute? V září federální odvolací soud odmítl argumenty Kalifornské univerzity v Berkeley, že škola má výhradní práva na patenty CRISPR, a potvrdil patenty Broad Institute na některé aplikace CRISPR.

Důležité však je, že CRISPR dorazil.

Takže k čemu můžeme CRISPR použít?

Takže. Mnozí z vás si přejí, abyste se s nimi seznámili. věcí.

Paul Knoepfler, docent na Lékařské fakultě Kalifornské univerzity v Davisu, řekl serveru Vox, že se díky CRISPR cítí jako „dítě v cukrárně“.

Na té nejzákladnější úrovni může CRISPR výzkumníkům výrazně usnadnit zjišťování, co různé geny v různých organismech vlastně dělají – například tím, že vyřadí jednotlivé geny a zjistí, které vlastnosti jsou tím ovlivněny. To je důležité: od roku 2003 sice máme k dispozici kompletní „mapu“ lidského genomu, ale ve skutečnosti nevíme, jakou funkci všechny tyto geny plní. CRISPR může pomoci urychlit screening genomu a genetický výzkum by díky tomu mohl masivně pokročit.

Výzkumníci také zjistili, že CRISPRů existuje celá řada. Takže CRISPR je vlastně docela široký pojem. „Je to jako termín ‚ovoce‘ – popisuje celou kategorii,“ řekl Zhang z Broadovy univerzity. Když lidé mluví o CRISPR, obvykle mají na mysli systém CRISPR/Cas9, o kterém jsme zde mluvili. V posledních letech však vědci jako Zhang objevili další typy proteinů CRISPR, které rovněž fungují jako genové editory. Například Cas13 dokáže editovat sestru DNA, RNA. „Cas9 a Cas13 jsou jako jablka a banány,“ dodal Zhang.

Skutečnou zábavu – a potenciálně i skutečná rizika – by mohlo přinést použití CRISPR k úpravám různých rostlin a živočichů. Článek Rodolpha Barrangoua a Doudna v časopise Nature Biotechnology z roku 2016 uvádí příval možných budoucích aplikací:

1) Úprava plodin, aby byly výživnější: Vědci zabývající se pěstováním plodin se již nyní snaží využít CRISPR k úpravě genů různých plodin, aby byly chutnější, výživnější nebo lépe přežívaly horko a stres. Potenciálně by mohli CRISPR využít k vystříhání alergenů v arašídech. Korejští vědci zkoumají, zda by CRISPR mohl pomoci banánům přežít smrtelnou houbovou chorobu. Někteří vědci prokázali, že CRISPR dokáže vytvořit dojnice bez rohů, což je obrovský pokrok pro dobré životní podmínky zvířat.

Nedávno začaly velké společnosti jako Monsanto a DuPont licencovat technologii CRISPR v naději, že vyvinou nové hodnotné odrůdy plodin. Tato technika sice zcela nenahradí tradiční techniky GMO, které dokáží transplantovat geny z jednoho organismu do druhého, ale CRISPR je nový univerzální nástroj, který může pomoci mnohem rychleji identifikovat geny spojené s požadovanými vlastnostmi plodin. Mohl by také vědcům umožnit vložit požadované vlastnosti do plodin přesněji než tradiční šlechtění, které je mnohem chaotičtějším způsobem záměny genů.

„S editací genomu můžeme absolutně dělat věci, které jsme dříve nemohli,“ říká Pamela Ronaldová, genetička rostlin na Kalifornské univerzitě v Davisu. Přesto varuje, že se jedná pouze o jeden z mnoha nástrojů pro modifikaci plodin – a úspěšné vyšlechtění nových odrůd může trvat ještě roky testování.

Je také možné, že tyto nové nástroje mohou přitáhnout kontroverze. Potraviny, u nichž bylo pomocí CRISPR vyřazeno několik genů, jsou v současnosti regulovány mírněji než tradiční GMO. Politici ve Washingtonu v současné době diskutují o tom, zda by nemělo smysl přehodnotit předpisy i v této oblasti. Tento článek pro Ensia od Maywy Montenegra se zabývá některými debatami, které CRISPR v zemědělství vyvolává.

2) Nové nástroje k zastavení genetických chorob: Vědci nyní používají CRISPR/Cas9 k úpravě lidského genomu a snaží se vyřadit genetické choroby, jako je hypertrofická kardiomyopatie. Chtějí ji také použít na mutace, které způsobují Huntingtonovu chorobu nebo cystickou fibrózu, a hovoří o tom, že ji vyzkouší na mutace BRCA-1 a 2 spojené s rakovinou prsu a vaječníků. Vědci dokonce prokázali, že CRISPR dokáže z T-buněk vyřadit infekci HIV.

Dosud to však vědci testovali pouze na buňkách v laboratoři. Než někdo zahájí klinické testy na skutečných lidech, je třeba překonat ještě několik překážek. Například enzymy Cas9 mohou občas „chybovat“ a upravovat DNA na neočekávaných místech, což by v lidských buňkách mohlo vést ke vzniku rakoviny nebo dokonce ke vzniku nových onemocnění. Jak uvedl pro STAT genetik Allan Bradley z anglického Wellcome Sanger Institute, schopnost CRISPRu způsobit v DNA spoušť byla „vážně podceněna“.

A přestože došlo také k významnému pokroku ve zlepšování přesnosti CRISPRu a snižování těchto necílových účinků, vědci nabádají k opatrnosti při testování na lidech. To je hlavní důvod, proč jsou Jiankuiovy pokusy s produkcí lidských dětí s genomy upravenými pomocí CRISPR tak kontroverzní a alarmující. Vědci, kteří zkoumali těch několik málo výsledků, které Jiankui veřejně odhalil, uvedli, že výsledky ukazují, že geny dětí nebyly editovány přesně. Na skutečném doručení editujících molekul do konkrétních buněk je také třeba ještě hodně zapracovat, což je do budoucna velká výzva.

3) Nová účinná antibiotika a antivirotika: Jedním z nejděsivějších faktů v oblasti veřejného zdraví je, že nám dochází účinná antibiotika, protože bakterie vůči nim vyvíjejí rezistenci. V současné době je obtížné a nákladné vyvíjet nová antibiotika na smrtelné infekce. Teoreticky by však bylo možné vyvinout systémy CRISPR/Cas9, které by některé bakterie likvidovaly přesněji než dosud (i když opět bude náročné vymyslet mechanismy jejich doručení). Další vědci pracují na systémech CRISPR, které se zaměřují na viry, jako je HIV a herpes.

4) Genové pohony, které by mohly změnit celé druhy: Vědci také prokázali, že CRISPR by teoreticky mohl být použit k úpravě nejen jednoho organismu, ale celého druhu. Jde o zneklidňující koncept zvaný „genový pohon“

Funguje to následovně: Za normálních okolností, kdykoli se organismus, jako je ovocná muška, páří, je šance 50 na 50, že předá daný gen svému potomkovi. Pomocí CRISPRu však mohou vědci tyto šance změnit tak, že je téměř stoprocentní šance, že se určitý gen předá. Pomocí tohoto genového pohonu by vědci mohli zajistit, aby se změněný gen v krátké době rozšířil v celé populaci:

S využitím této techniky by vědci mohli například geneticky upravit komáry tak, aby produkovali pouze samčí potomstvo, a pak pomocí genového pohonu prosadit tuto vlastnost v celé populaci. Časem by populace vyhynula. „Nebo by stačilo přidat gen, který by je učinil odolnými vůči parazitovi malárie, čímž by se zabránilo jejímu přenosu na člověka,“ vysvětluje Dylan Matthews ze serveru Vox ve svém článku o genovém pohonu CRISPR pro malárii.

Je třeba říci, že než bude tato technologie masově rozšířena, je třeba překonat i překážky – a ne nutně ty, které byste očekávali. „Problém genových pohonů pro malárii se rychle stává spíše problémem politiky a řízení než problémem biologie,“ píše Matthews. Regulační orgány budou muset přijít na to, jak s touto technologií zacházet, a etici se budou muset vypořádat se zapeklitými otázkami ohledně její spravedlnosti.

5) Vytváření „designových dětí“: Tomuto tématu je věnována největší pozornost, a to oprávněně. Není úplně přitažené za vlasy, že bychom si jednoho dne mohli být dostatečně jisti bezpečností CRISPRu, abychom jej mohli použít k úpravě lidského genomu – k odstranění nemocí nebo k selekci atletických jedinců či jedinců s vyšší inteligencí.

Nedávný pokus Jiankuiho zavést ochranu před HIV u embryí určených k otěhotnění, který zahrnoval jen malý dohled, však není tím, jak si většina vědců přeje, aby se tento obor posunul kupředu.

Obavy spočívají v tom, že zatím neexistuje dostatek záruk, které by zabránily škodám, ani dostatek znalostí, které by přinesly definitivní dobro. V Jiankuiově případě navíc o svém experimentu předem neinformoval svou univerzitu, pravděpodobně plně neinformoval rodiče upravených dětí o souvisejících rizicích a možná měl finanční pobídku od svých dvou spřízněných biotechnologických společností.

Nejsme ani blízko bodu, kdy by vědci mohli bezpečně provádět komplexní změny potřebné například ke zlepšení inteligence, částečně proto, že se to týká tolika genů. Takže ještě nesněte o Gattace.

„Myslím, že realita je taková, že zatím nerozumíme dostatečně lidskému genomu, tomu, jak se geny vzájemně ovlivňují, které geny dávají vzniknout určitým vlastnostem, abychom dnes mohli provádět úpravy za účelem vylepšení,“ řekl Doudna v roce 2015. Přesto dodala: „To se časem změní.“

Počkat, opravdu bychom měli vytvářet designové děti?

Vzhledem ke všem ožehavým otázkám spojeným s editací genů zde mnoho vědců prosazuje pomalý přístup. Snaží se také udržet konverzaci o této technologii otevřenou a transparentní, budovat důvěru veřejnosti a vyvarovat se některých chyb, které se staly v případě GMO. Vzhledem ke snadnému použití CRISPR a nízkým nákladům je však náročné udržet nepoctivé experimenty na uzdě.

V únoru 2017 se ve zprávě Národní akademie věd uvádí, že klinické testy by mohly mít v budoucnu zelenou „u závažných stavů pod přísným dohledem“. Zároveň však jasně uvedla, že „editace genomu za účelem vylepšení by v současné době neměla být povolena.“

Společnost se stále musí vypořádat se všemi etickými aspekty, které jsou zde ve hře. Pokud bychom například editovali zárodečnou linii, budoucí generace by neměly možnost se z ní odhlásit. Genetické změny by mohlo být obtížné vrátit zpět. I tento postoj znepokojuje některé vědce, například Francise Collinse z Národního ústavu zdraví, který prohlásil, že americká vláda nebude financovat žádnou genomickou editaci lidských embryí.

Mimochodem, výzkumníci v USA, kteří mohou získat vlastní finanční prostředky, spolu s dalšími ve Velké Británii, Švédsku a Číně, pokračují ve svých vlastních experimentech.

Další čtení

• Julia Belluzová se zabývala důsledky překvapivého oznámení He Jiankui o lidských dětech s upravenými genomy a vyhlídkami klinik CRISPR v USA.
• Psali jsme také o dvou nástrojích CRISPR, které překonávají nejděsivější části editace genů.
• Ezra Klein v říjnu ve svém podcastu vyzpovídal Jennifer Doudnovou z Kalifornské univerzity v Berkeley, jednu z předních výzkumnic CRISPR.
• Michael Specter v New Yorkeru napsal článek „Rewriting the Code of Life“.
• Carl Zimmer se CRISPR věnuje již dlouho. Jeho článek z roku 2015 v časopise Quanta stojí za přečtení.
• Sharon Begleyová se CRISPRu také věnuje a nedávno rozvedla nejnovější studie o potenciální škodlivosti editace genů.
• V roce 2016 se časopis Nature zabýval některými jemnými omezeními CRISPRu – a hledáním dalších nástrojů pro úpravu genů. A tento dřívější článek v časopise Nature od Heidi Ledfordové je rozkošně vyhraněným ponorem do způsobů, jakými by vědci mohli CRISPR využít ke zkoumání genomu. Za přečtení stojí také tento článek s výčtem všech budoucích aplikací CRISPR.

.