Pohlavní produkce geneticky identických organismů je známá jako klonování, zahrnuje rozdělení jednoho embrya, buď jaderné geny a malý počet mitochondriálních genů by byly „identické“, nebo může zahrnovat přenos jader, v takovém případě by byly „identické“ pouze jaderné geny. Po mnohaletém boji v roce 1995 naklonovali vědci v „Roslin Institute“ ve Skotsku dvě jehňata „Megan a Morag“, která byla naklonována z buněk z raného embrya,1 ačkoli obojživelníci byli úspěšně naklonováni již v 50. letech 20. století. Poté se objevily zprávy, že se klonováním narodila řada jehňat. V únoru 1997 se po 277 pokusech podařilo naklonovat jehně pojmenované jako „Dolly“, jehož délka života byla o dost delší než u ostatních klonovaných jehňat.2 Klonování Dolly předznamenalo začátek nového období v zemědělství s možností ochrany a rychlého množení vybraných genotypů.3 Doposud bylo jaderným přenosem naklonováno mnoho živočišných druhů savců, jako jsou ovce, kozy, skot, králíci, myši.4 Klonování má mnohostranné využití a usnadňuje rychlé rozmnožování žádoucích stavů zvířat, množení transgenních hospodářských zvířat, cílené genetické změny u domácích zvířat a ochranu ohrožených druhů.1 Některé otázky však stále nejsou vyřešeny, například etické a morální otázky a nízká úspěšnost přenosu jader somatických buněk v důsledku epigenetických chyb v důsledku nepřesného jaderného programování,5 všechny tyto faktory omezují uspokojivost a použitelnost klonování v zemědělství.
Omezení klonování je způsobeno komplexní souhrou mnoha důvodů, jako jsou dobré životní podmínky zvířat a nedostatečná důvěra v dlouhodobé zdraví klonovaných zvířat.6 Během používání techniky klonování se většinou zdánlivě kvalitní embrya během těhotenství nebo po narození nevyvíjejí dobře.7 Hlavní příčinou neúspěchu je selhání při přeprogramování darovaného jádra, protože je důležité pro správný vzorec genové exprese, k němuž má dojít během následné embryogeneze.8 Toto přeprogramování musí proběhnout v krátkém časovém horizontu, v jiném buněčném kontextu než při normálním vývoji a je náchylné k chybám. Existuje stále větší množství údajů dokumentujících odchylky v epigenetickém přeprogramování.9
Počet neúspěšných klonování je velmi vysoký,10 mnoho klonovaných embryí se může vyvinout do preimplantačního stadia, ale naprostá většina z nich nevyústí v životaschopné těhotenství.11 Přestože byly jako příjemkyně použity zdravé, plodné synchronní samice, bylo zjištěno, že k 50 % ztrátám došlo během časného filmového trimestru a téměř 80 % potratů do druhého trimestru většinou v důsledku placentárních abnormalit.12 Podle studií u krav a ovcí je nejdramatičtější období ztrát plodu v době připojení placenty.4 Po ukončení březosti se klonovaná zvířata potýkají s většími obtížemi při adaptaci na mimoděložní život,13 vypadají jako normální, ale geneticky se liší a tyto rozdíly jsou způsobeny epigenetickými abnormalitami získanými během jaderného přeprogramování.10 U klonovaných zvířat se vyskytuje mnoho těhotenských a novorozeneckých abnormalit,12 které mohou být způsobeny nepravidelnou expresí a pravděpodobně neúplným přeprogramováním imprintovaných genů.14 Podle některých dalších zpráv je rozdíl způsoben abnormalitami v délce telomer, genové expresi nebo metylačních vzorcích.4
Dalším problémem, který se vyskytuje u klonovaných zvířat, jsou placentární abnormality. Podle mnoha vědců je předčasné úmrtí embrya způsobeno špatným vývojem placenty. U klonovaných zvířat byl zaznamenán abnormální vývoj alontoické membrány a snížený vývoj placentárních cév, počet placent je u klonovaných zvířat o něco menší15 a zdá se, že placentární schopnost výměny plynů je významně snížena, protože u klonovaných plodů v pozdní graviditě byla zjištěna hypoxie.16
Postnatální životaschopnost klonovaných potomků je u klonovaných zvířat nižší, ale závisí na zvířeti.17 U postnatálních mláďat se většinou projevily problémy s dýcháním18, kardiovaskulárním, kosterním a centrálním nervovým systémem.7 Potenciální vliv epigenetických chyb na složení klonovaných zvířat je důvodem, proč bezpečnost odvozených potravinářských výrobků měla hlavní překážku při získávání regulačního schválení pro vstup do potravinového řetězce.
Epigenetické anomálie
Epigenetika znamená “studium mitoticky a/nebo meioticky dědičných změn ve funkci genů, které nelze vysvětlit změnami v sekvenci DNA.19 Podle teorie by klon a dárcovské zvíře měly mít stejný genom, ale není pravděpodobné, že by klonovaní savci občas vykazovali vývojové anomálie způsobené epigenetickými chybami.20 Někdy se u klonovaných přežvýkavců běžně vyskytuje přerůstání placenty a plodu označované jako „syndrom velkého potomka „15 , další anomálie zahrnují dýchací potíže, závažné kardiovaskulární abnormality a zvětšení orgánů21 , proto je použitelnost klonování v zemědělství velmi omezená.22
Praktickým výsledkem je, že existuje mnoho klonovaných zvířat, která se chovají a vypadají normálně, zatímco bližší zkoumání odhalilo, že i některá z těchto zdánlivě normálních zvířat se jemně liší od přirozeně vyprodukované populace.23 Při klonování, kdy je somatická buňka přenesena z dárce na příjemce, musí být v té době somatické buněčné jádro urychleně přeprogramováno, aby předpokládalo svůj nový život embryonální buňky.24 V každém případě, pokud buňka není schopna přeprogramování nebo při úplném přeprogramování vede k abortivnímu vývoji a případně neletálním abnormalitám u přeživších klonů.4 Některé geny jsou u klonovaných embryí exprimovány správně, například důležité metabolické enzymy, ale exprese některých jiných genů je většinou abnormální a ovlivňuje budoucí život klonu. V takovém stavu většinou klon zřejmě prodělal normální těhotenství a novorozenecké období, vyhlídky na normální život se zdají být dobré, ale vývoj placenty a nitroděložní prostředí je u mnoha klonů suboptimální, a to samo o sobě může mít vliv na jejich zdraví v pozdějším životě.25
Metylace DNA hraje důležitou roli v expresi genů, které řídí vývoj živočichů.5 Uvádí se, že epigenetické chyby jsou především ve vzorcích metylace DNA a organizaci chromatinu u klonovaných embryí.19 Často se během vývoje před implantací zachovává vzor metylace DNA dárcovských buněk14 , což vede k přeprogramování účinku a způsobuje abnormální placentaci.26 Sekundárně je to důležitý důvod nízké porodnosti.24
Placentární abnormality
Placenta je hlavním orgánem materno-fetálního kontaktu, hraje zásadní roli při udržování těhotenství a udržuje plod tím, že uspokojuje pozitivní rozdělení živin a kritické endokrinní funkce. Přežití a vývoj plodu během těhotenství závisí na vhodném morfologickém a funkčním vývoji placenty. Klonování je vždy spojeno s abnormalitami placenty a K indikacím selhání placenty u těhotenství s přenosem jader patří anomálie, jako je syndrom velkého potomka, změněné proteiny placenty a membrány plodu, zvýšená hmotnost placenty a zvětšení placenty a edém u skotu.27 Hydroallantois byla Farinem klasifikována jako stav typu II abnormálního offspring syndromu v Tento patologický stav placenty zvyšuje fluid plodu a vytváří obtíže při lokalizaci plodu v děložním rohu.27
V časné březosti klonovaných zvířat se úmrtnost plodu blíží přibližně 80 %26 , což je většinou způsobeno špatnou funkcí a nedostatečným vývojem placenty.15 U skotu je typické, že 50-70 % březostí v 50. dni je ztraceno po celý zbytek březosti a až do termínu porodu kvůli nedostatečné vaskularizaci placenty a místům uchycení, která jsou důležitá pro výměnu živin a zabraňují hypoxickému stavu plodu.7 Ve třetím trimestru u krav březích s klonovaným plodem byly také zaznamenány některé abnormality placenty, jako je edém a hydroallantois s pravděpodobností výskytu kolem 45 %.28 Stav hydroallantois se nejčastěji pozoruje mezi 150. a 180. dnem klonovaného těhotenství.28 Podle výzkumů může být dysfunkce a zvětšení placenty způsobeno proteiny placenty, které vykazovaly nadměrnou expresi TIMP-229 , ale podle některých jiných to může být způsobeno změnou exprese genů v trofoblastu klonovaných placent.30
Problémy při porodu
V současné době má klonování obecně nízkou efficienci, což je způsobeno poměrně velkým množstvím faktorů, jako je přeprogramování jádra, diferenciace dárcovských buněk a situace oocytu.31 Období přeprogramování je klíčovou fází pro optimalizaci klonování.32 Pokud v té době reprogramování neprobíhá správně, vede to k epigenetickým abnormalitám a zvyšuje úmrtnost. a somatická klonovaná mláďata jsou zřejmě těžší než embryonální klony33 , což je také příklad epigenetických abnormalit, které zvyšují porodní komplikace.13 Velké rozměry plodu včetně všech novorozeneckých abnormalit v důsledku epigenetické chyby označované jako „syndrom velkého telete“.34 Je běžné, že délka těhotenství u těhotenství s nukleárním transferem se citlivě prodlužuje, což je způsobeno selháním placenty při uvolňování kortizolu plodu v blízkosti termínu porodu nebo nedostatečným uvolňováním ACTH z plodu.26 Hormonální nerovnováha a velká velikost plodu jsou krokem k dystokii, kromě souvisejících poporodních problémů mohou mít také vážné negativní dopady na zdraví matky i její budoucí produkci a reprodukční výkonnost ve stádě.7
Předporodní a poporodní životaschopnost
Embryo je považováno za kvalitní, pokud je počet buněk poměrně dobrý, protože je to důležité kritérium, které ověřuje životaschopnost embrya po přenosu do náhradní matky, takže nízký počet buněk v klonovaném embryu bude u několika druhů spojen s nízkým procentem životaschopnosti po přenosu embrya.35 Klonovaná embrya skotu s vyšším procentem apoptotických blastomer vykazovala nižší míru březosti po 90 dnech od přenosu embrya a následně nižší míru otelení.36
Postnatální životaschopnost je u mnoha klonovaných výrazně nižší.37 Podíl narozených klonovaných telat, která přežívají delší dobu, se pohybuje mezi 47 % a 80 %.38 Po narození klonovaná telata a jehňata běžně vykazují známky stresujícího děložního prostředí; Placentární rezervní kapacita je pravděpodobně omezená v důsledku nedostatečného vývoje.7 Je zřejmé, že životaschopnost plodu u klonovaných zvířat se liší mezi jednotlivými pokusy a druhy, přičemž klonované myši a kozy vykazují lepší postnatální životaschopnost, která může být způsobena technikou, kmenem zvířat nebo typem placenty.26 U klonovaných mláďat byly zaznamenány i některé další případy, kdy se u klonovaných mláďat vyskytla slitá pupeční šňůra, která může být potenciální příčinou úmrtí v postnatálním období.39 U klonovaných mláďat jsou důležitou příčinou úmrtí v postnatálním období také rozšířené pupečníkové žíly a tepny v důsledku sepse v pupečníkových strukturách.39
Podle nových výzkumů jsou příčinou postnatálního úmrtí také cévní problémy, jako je plicní hypertenze, léze, edém a pleurální výpotky, navíc kapilární překrvení alveolárních sept a plicní trombóza způsobující hemodynamické poruchy. Tyto změny pravděpodobně bránily úplnému rozšíření alveolů a vysvětlovaly plicní insuficienci, která přispívala k nízké míře postnatálního přežití klonovaných telat.40 Tyto cévní vývojové problémy vyústily jako primární nebo klíčové změny v důsledku epigenetických modifikací způsobených klonováním.
Ačkoli tyto konkrétní epigenetické aberace mohou být zanedbatelné a nepředstavují problém pro welfare zvířat, mohou omezovat některé praktické aplikace této technologie, protože snižují potenciální uniformitu klonovaných hospodářských zvířat.41 Fenotypem klonů dobře známých diagonálních druhů je potvrzení narušeného imunitního systému, s aplazií thymu u klonovaného skotu a nižší produkcí protilátek u klonovaných myší.26 Kompromitovaný imunitní systém může zvýšit jejich náchylnost k infekcím a nemocem.9
V postnatálním období Krevní vzorky odebrané klonovaným jehňatům po narození odhalily širokou škálu abnormalit svědčících o dysfunkci ledvin a jater.32 Další ztráty v průběhu postnatálního období jsou většinou způsobeny abnormalitami kardiovaskulárního, kosterního a centrálního nervového systému, pupečníkovými a plicními infekcemi spolu s poruchami trávení a ledvin.7 Postnatální ztráty u ovcí jsou větší než u skotu.26
Fenotypy dospělých klonů
Pokud jsou expresní vzorce genů abnormální v době preimplantace a v raných fázích implantace, pak bude abnormální i morfologie klonu.42 Ve většině případů klon vypadá normálně a má normální fyziologii, ale přesto se objevuje mnoho zpráv, které vykazují abnormality spojené s fenotypem,41 jako například „syndrom velkého potomka“.9 Ten je způsoben chybou v genové expresi růstu a vývoje plodu.43 Výskyt těchto anomálií se může lišit v závislosti na druhu, genotypu, pohlaví, typu buňky nebo specifických aspektech protokolu přenosu jader.4
Vysoká míra selhání
Jednou z překážek praktického využití technik zahrnujících přenos jader somatických buněk je nízká možnost vývoje klonovaných embryí; pouze několik procent rekonstruovaných oocytů je vždy schopno vývoje.43 Dosavadní úspěšnost v případě klonování intra species je 1 %44 , a to i přes použití zdravé a synchronizované příjemkyně a navíc dobré kvality použitého embrya. U většiny savčích druhů zůstává hodnocení morfologie embrya metodou výběru různých použitelných embryí dříve, než dojde k transferu. Je to nejreálnější a klinicky nejpřínosnější způsob hodnocení životaschopnosti embryí14. Přesto je však ve většině případů hlášena významná ztráta těhotenství v časných vývojových stadiích přibližně ve věku 30-90dnů gravidity45 v důsledku selhání placentární membrány a snížení vývoje placentárních cév,39 uvádí se, že v časném filmovém trimestru je počet těhotenství menší než 1/2 běžně očekávaného, ztráta embryí je velmi vysoká a téměř 80 % potratů do druhého trimestru, navíc v pozdní graviditě je vysoká pravděpodobnost vzniku placentárních a fatálních abnormalit než normálních.7 Hlavní příčinou ztrát ve třetím trimestru jsou hydroallantois a hydrops plodu, které se obvykle připisují nedostatečné placentaci.16 V literatuře se také uvádí, že ztráty klonovaného plodu jsou způsobeny také hypoxickým stavem, protože u klonovaného zvířete je menší počet placent, které jsou schopny vyměňovat méně živin z matky do plodu a vytvářet nepříznivé podmínky pro vývoj plodu.15
Vysoká míra ztrát březosti a úmrtí novorozenců klonovaných mláďat k je způsobena neúplným jaderným přeprogramováním; několik autorů přesvědčivě potvrdilo, že dárcovská somatická buňka je přeprogramována tak, že expresní vzorec ve stadiu blastocysty se výrazně liší od expresního vzorce somatické buňky před přenosem jádra.46 Podle Arnolda et al.,47 exprese genů kritických pro normální vývoj placenty je u klonovaných hovězích embryí deformovaná, což pravděpodobně způsobuje abnormální diferenciaci trofoblastu a přispívá ke ztrátě těhotenství. I probíhající potomci mají velké placenty a zvýšenou porodní hmotnost, známou jako syndrom velkých potomků14 , a někteří se zdánlivě zdravým vzhledem prodělávají imunitní dysfunkci, což vede ke zvýšené úmrtnosti.24
Podle jedné zprávy Marfila a kol.48 u klonovaných telat respirační potíže 19 % a v tomto stavu telata uhynula bez jakýchkoli dalších známek abnormality. Zvětšená pupeční šňůra 37 %, hyper/hypotermie 17 % a depresivní/prolongovaná ležení 20 % jsou nejčastějšími příčinami úmrtí mezi 24 a 60 dny po narození. Mezi problémy, které mohou snížit přežití těchto telat v době porodu nebo v jeho okolí, patří prodloužená délka březosti, těžká dystokie, nedostatečný vývoj a funkce placenty a poruchy metabolických pochodů nezbytných pro mimoděložní život a některé vrozené problémy, jako je hypoplazie mozečku, respirační potíže a zvětšení srdce.4
Může být normální, že klony mají jinou citlivost na stres ve srovnání s konzervativními zvířaty, kvůli tomu jsou náchylnější k patogenům, což může také zvýšit úmrtnost klonů.23 Aby převážila nízká účinnost klonování, byly vyzkoušeny různé metody, například použití různých typů dárcovských buněčných linií, různých kultivačních systémů, různých metod fúze a chemických látek.35 Některé z těchto výzkumných snah vedly k menšímu zlepšení kvality klonovaných embryí, což úzce souvisí s vývojem embryí a produktivitou potomstva.
Etika
Klonování zvířat je klíčem k rozvoji v oblasti zemědělství a medicíny, ale je přijatelné pouze tehdy, pokud jsou jeho cíle a metody eticky odůvodněné a pokud je prováděno za etických podmínek. Vědci provádějí rozsáhlý výzkum v oblasti klonování zvířat, ale nyní vyvstává mnoho etických otázek. Pozoruhodná neúčinnost klonování představuje vážnou hrozbu pro dobré životní podmínky zvířat.49 Často méně než jedno procento pokusů o klonování vyústí v úspěšný porod a z těch, které se narodí, je jen poměrně malé procento natolik zdravé, aby žilo déle než několik dní nebo týdnů.35 Podle jednoho průzkumu je 64 % lidí v USA proti klonování, protože si myslí, že je v rozporu s dobrými životními podmínkami zvířat, a proto je morálně špatné.50
Při klonování je nejzávažnějším etickým důsledkem bolest, kterou zvíře při tomto procesu trpí, a kromě toho má klonování vliv i na ostatní populace zvířat. Kvůli tomu může být klonováním zvířat vážně postižen i člověk, a to ohrožením bezpečnosti hospodářských zvířat používaných při výrobě potravin.51 Klonování má špatný vliv jak na dárce, tak na příjemce, protože při klonování se nejprve provede chirurgický zákrok k odebrání vajíčka dárkyni a poté opět chirurgický zákrok příjemce k implantaci vajíčka s co nejmenší šancí na dosažení cíle, navíc pokud zvíře úspěšně dokončí délku březosti, je z neznámého důvodu nutný císařský řez17 , kvůli němuž zvíře opět trpí bolestí.
Hlášeny jsou i některé další problémy, při nichž zvíře trpí bolestí a které jsou v rozporu s dobrými životními podmínkami zvířat, jako je hydroallantois, typicky smrtelný stav, při němž březí zvíře otéká tekutinou, až to vypadá, že každou chvíli praskne48. Je zřejmé, že embrya vzniklá přenosem jádra mohou v některých případech vést k nestabilnímu vývoji plodu a ke zvýšenému výskytu dystokie, sectio caesarea a perinatálního úmrtí, což může mít negativní účinky na příjemce a potomstvo.52 Všechny tyto věci kumulativně vyvolávají morální problémy. Biodiverzita je záchranná síť, která chrání před šířením nemocí u zvířat, ale klonování je snaha o fixaci s jednou sadou žádoucích genů a vytvoření přesných kopií zdrojového zvířete, což je v rozporu s diverzitou a také vyvolává řadu etických problémů.53
Bezpečnost potravin
Každá země má speciální oddělení, které se zabývá potravinářskými produkty vyrobenými biotechnologií. Živočišné biotechnologické produkty však musí projít hodnocením bezpečnosti, které se provádí před tím, než veřejnost a vláda schválí jejich použití pro lidskou spotřebu.23 Možná schopnost epigenetických chyb změnit složení potravin, proto jsou potravinářské produkty získané z klonovaných hospodářských zvířat hlavní překážkou při získávání regulačního schválení pro vstup klonovaných produktů do potravinového řetězce. Krmný pokus na potkanech navíc potvrdil, že využití masa z klonovaných zvířat nemělo žádný vliv na tělesný růst, příjem potravy, celkovou kondici, aktivitu pohybového aparátu, reflexy, pohlavní cyklus, vyšetření moči, hematologii, biochemii krve nebo histologii.23 Vzhledem k tomu, že tato technologie je stále považována za novou a neznámou, a navíc chybí jakékoli produkty s přímými benefity pro dnešního spotřebitele, není šokující, že současné přijetí je nízké. Nicméně dozrávání technologie a dostupnost takových výrobků v kombinaci se stárnutím populace ve vyspělých západních zemích, která má silnou touhu zůstat déle zdravá, by nakonec mohly zvýšit její přijetí.54