Návrh genu, technologie fúze a podmínky štěpení TEV ovlivňují purifikaci jedových peptidů bohatých na oxidované disulfidy v Escherichia coli

Použití kodonů u genů kódujících jedové peptidy způsobuje rozdíly v expresi

K výzkumu vlivu použití kodonů na rozpustnost purifikovaných proteinů bylo vybráno 24 různě dlouhých genů kódujících jedové peptidy různých druhů a obsahujících různý počet disulfidových můstků. Tyto geny kódují jedové peptidy, které jsou evolučně, strukturně a funkčně rozmanité. Cílem experimentu je vyhodnotit, zda jemné změny v použití kodonů mohou ovlivnit hladiny exprese rekombinantních peptidů v E. coli. Tři varianty každého genu byly původně navrženy zpětným překladem sekvencí jedových peptidů pomocí algoritmu Monte Carlo pro opakovaný náhodný výběr kodonů pravděpodobnostním způsobem z vyhledávacích tabulek frekvencí kodonů. Použití kodonů 72 navržených genů (3 varianty 24 genů) je uvedeno v doplňkovém souboru 5: tabulka S5 a odráží použití kodonů genů Escherichia coli exprimovaných na střední až vysoké úrovni. Vytvořené varianty genů však zahrnovaly změny v primárních sekvencích DNA, které odrážejí náhodný výběr kodonů a celkovou volnost povolenou algoritmem použitým pro návrh genů. Průměrná párová identita sekvencí DNA tak činila 79,8 % v rámci tří variant 24 souborů dat.

Syntetizováno bylo 72 genů, které byly klonovány pomocí systému Gateway do prokaryotického expresního vektoru pETG82A pod kontrolou promotoru T7 a ve fúzi s genem kódujícím fúzní značku DsbC pro cytoplazmatickou expresi. E. coli BL21 (DE3) pLys S byly transformovány 72 plazmidy a kultivovány v autoindukčním médiu. Fúzní proteiny byly přečištěny a integrita a výtěžnost proteinů byly měřeny pomocí analýzy Caliper Labchip GXII (obr. 1a). V závislosti na peptidu, který je předmětem zájmu, probíhají purifikované frakce na čipu Caliper Labchip GXII převážně jako jeden pás (peptidy 1, 2, 3, 4…) nebo jako dvojitý pás (5, 8, 16, 18…). Jednoduchý pás představuje populaci dobrého proteinu (His-DsbC-peptid), zatímco spodní pás (kolem 29 kDa) odpovídá samotnému His-DsbC proteinu po zkrácení/degradaci cílového peptidu. Tento nižší pás pravděpodobně naznačuje, že existuje část populace peptidů, která nebyla správně složena a byla degradována během exprese nebo purifikace. Koncentrace proteinu zobrazená na obr. 1b byla vypočtena integrací pouze His-DsbC-peptidového pásu pomocí softwaru Caliper. Údaje uvedené na obr. 1b ukázaly, že výtěžky purifikovaného fúzního proteinu se pohybovaly od ∼1 mg/l (pro fúzní protein 14) do více než 100 mg/l (pro fúzní proteiny 4, 5, 8, 9, 10, 18 a 24). U naprosté většiny cílových proteinů (19/24) by množství purifikovaného fúzního proteinu umožnilo purifikaci miligramového měřítka cílového peptidu na litr kultury (za předpokladu štěpení a výtěžnosti purifikace kolem 100 %), zatímco u zbývajících pěti peptidů (6, 7, 11, 13 a 14) by byl zapotřebí větší objem kultury.

Byla analyzována korelace mezi primární sekvencí variant genů a vlastnostmi, které podle předpokladů ovlivňují expresi. Deleterní motivy, jako je 5′ sekundární struktura mRNA, nemohly ovlivnit úroveň exprese, protože všechny jedové geny byly fúzovány se stejnou 5′ primární sekvencí, která kóduje proteinovou fúzní značku. Nebyla zjištěna žádná korelace mezi expresí proteinu a počtem disulfidických můstků, velikostí peptidu, hodnotou CAI a obsahem GC (údaje nejsou uvedeny). To naznačuje, že rozdíly v expresi genů byly určeny jinými vlastnostmi souvisejícími se sekvencí, zejména použitím kodonů. Za účelem zjištění, jak změny v použití kodonů ovlivnily hladiny rekombinantních peptidů, byl porovnán vztah mezi výtěžky proteinů u variant s nízkou, střední a vysokou expresí v rámci 24 souborů dat. Fúzní proteiny exprimující na nižších úrovních, které se týkají peptidů 6, 7, 11, 13 a 14 (obr. 1), byly z analýzy vyloučeny. Z údajů vyplynulo, že výtěžky proteinů analyzovaných peptidů u variant s vysokou, střední a nižší expresí se významně liší. Nižší expresory tak produkovaly v průměru 65,1 mg/l rekombinantního fúzního proteinu, zatímco výtěžek fúzního proteinu vyšších expresorů činil v průměru 87,55 mg/l (obr. 1b). Tyto rozdíly se významně liší (p = 0,01).

Pro vyhodnocení toho, jaké rozdíly v použití kodonů by mohly vysvětlit pozorované rozdíly v expresi proteinů, bylo porovnáno použití kodonů u variant s nízkou a vysokou expresí. Tabulky použití kodonů včetně genů obsahujících fúzní značku jsou uvedeny v tabulce S6. Hlavní rozdíly v použití kodonů se týkají zejména jedné aminokyseliny, cysteinu, i když mírné změny byly pozorovány i u dalších zbytků, zejména argininu, asparaginu, glutamátu, histidinu, isoleucinu, fenylalaninu a serinu. Souhrnné údaje o použití kodonů pro těchto 8 aminokyselin jsou uvedeny v tabulce 1. Kodonová odchylka pozorovaná u genů s nízkou expresí odhalila preferenci kodonu Cys-TGC, zatímco u genů s vysokou expresí je upřednostňován kodon Cys-TGT. Navíc u genů s nízkou expresí se Cys-TGC používá 1,38krát častěji než Cys-TGT, zatímco u genů s vysokou expresí se Cys-TGT používá pouze 1,04krát častěji než Cys-TGC. Ačkoli nakonec mohou působit i jiné faktory, toto pozorování naznačuje, že vysoká exprese genů kódujících peptidy vyžaduje podobný podíl kodonů Cys-TGC i Cys-TGT, což naznačuje, že vyšší procento jednoho kodonu ve srovnání s druhým ovlivní expresi. Využití cysteinových kodonů u E. coli také ukazuje na vyváženější využití obou kodonů (tabulka 1). Pro zkoumání faktorů, které mohou vysvětlit toto pozorování, byla porovnána frekvence aminokyselin v genech E. coli a v rámci 24 jedových peptidů vybraných pro tuto studii a s nimi spojených fúzních proteinů. Údaje uvedené na obr. 2 ukázaly, že cystein je ~12,5krát a 3,5krát častější v jedových peptidech (14,3 %) a v rekombinantních fúzních proteinech (4,1 %) než v E. coli (1,16 %). Údaje tedy naznačují, že expresi jedových peptidů na vysokých úrovních podporuje přítomnost dvou cysteinových kodonů s podobnou frekvencí v syntetických genech. To by mělo zabránit vyčerpání jednoho kodonu při expresi genů ve velmi vysokých hladinách.

Úroveň exprese jedových peptidů je ovlivněna fúzní značkou

Pět nových vektorů pro expresi rekombinantních proteinů v E. coli bylo zkonstruováno vložením různých fúzních značek do páteře pHTP1. Všechny fúzní značky mají být vloženy na N-konec rekombinantních peptidů (obr. 3). Dva z vektorů kódují fúzní partnery, které obsahují signální peptid pro zacílení exprese jedového peptidu do periplazmy (pHTP4, pHTP6). Zbývající fúzní značky povedou k cytoplazmatické expresi rekombinantního proteinu (obr. 3). Ve všech případech byla zavedena značka 6HIS, která umožňuje následné čištění fúzních proteinů pomocí imobilizované niklové afinitní chromatografie. Do všech syntetických genů bylo zavedeno štěpné místo TEV (tabákový etch virus) proteázy (ENLYFQ/G), aby bylo možné odstranit fúzního partnera. Kromě samotné afinitní značky 6HIS (pHTP1) obsahuje 5 nových vektorů disulfidovou izomerázu DsbC nebo protein vázající maltózu (MBP). Byl vytvořen neaktivní mutantní derivát DsbC, aby bylo možné rozlišit roli DsbC v pasivní solubilizaci (týkající se výtěžku fúzního proteinu) a redoxní aktivitě (týkající se výtěžku správně složeného cílového peptidu). Schematické znázornění všech vektorů použitých v této studii je uvedeno na obr. 3.

Pro tuto studii bylo vybráno šestnáct dobře charakterizovaných jedových peptidů (včetně 7, které byly součástí výše popsaného experimentu s využitím kodonů) s různým původem a reprezentujících různé záhyby a vzory cysteinových vazeb (viz tabulka S3). Těchto 16 syntetických genů bylo vloženo do šesti různých expresních vektorů (viz tabulka S2 a obr. 3), čímž vzniklo celkem 96 rekombinantních plazmidů. Těchto 96 konstruktů bylo transformováno do BL21 (DE3) pLysS. Rekombinantní kmeny E. coli byly pěstovány v autoindukčním médiu, aby se dosáhlo vysoké hustoty buněk. Po afinitní purifikaci niklem byla provedena systematická analýza elektroferogramů Labchip GXII za účelem stanovení koncentrace purifikovaných proteinů a porovnání zdánlivé molekulové hmotnosti purifikovaných fúzních proteinů s jejich očekávanou teoretickou molekulovou hmotností. Údaje uvedené na obr. 4 ukázaly, že 16 peptidů lze skutečně získat pomocí fúzní značky. V závislosti na použitém peptidu a fúzní značce se množství purifikovaných fúzních proteinů pohybovalo od nuly (většinou když byly peptidy klonovány v pHTP1) až po více než 300 mg purifikovaného fúzního proteinu na litr kultury. Celkově se zdálo, že menší peptidy se vyrábějí snadněji než větší, ale existuje několik protipříkladů (jako T16, který je největším peptidem studie). Pro peptidy 2, 4, 7, 8, 9, 14 a 15 se zdály být vhodné různé vektory pro expresi fúzního proteinu, ale ve většině případů (13 ze 16) překonal vektor pHTP4 (DsbC) všechny ostatní vektory. Naproti tomu bez výjimky byla rozpustná exprese se samotnou značkou 6HIS vždy velmi nízká. Přítomnost signálního peptidu vedla u DsbC ve všech případech (pHTP4 oproti pHTP2) k vyšší úrovni exprese, která v průměru zdvojnásobila množství exprimovaného fúzního proteinu. U MBP (pHTP6 versus pHTP5) má jeho přítomnost podobný trend (10/16). U ostatních šesti peptidů byla buď cytoplazmatická hladina podobná (1, 5, 11), nebo dokonce výrazně lepší (2, 7, 14). Celkově z 16 peptidů, kdy nebyla nejlepší volbou periplazmatická DsbC, byla nejlepší volbou cytoplazmatická (pro peptidy 2 a 14) nebo periplazmatická (peptid 4) MBP. A konečně, inaktivace biologické funkce DsbC neměla žádný vliv na úroveň exprese fúzních proteinů jedových peptidů, protože exprese pHTP2 a pHTP3 byla obecně velmi podobná.

Štěpení fúze, výtěžek peptidů a správný oxidační stav je ovlivněn především fúzním partnerem a koncentrací DTT ve štěpicím pufru TEV

Optimální podmínky štěpení TEV pro uvolnění cílových peptidů z fúzních značek jsou ovlivněny několika parametry včetně poměru enzym/substrát, složení pufru, inkubační doby a teploty. Aby se zjistilo, které podmínky povedou k nejlepšímu výtěžku složených jedových peptidů, bylo vybráno osm peptidů ze seznamu 16 peptidů vytvořených v předchozím experimentu (viz doplňkový soubor 3: tabulka S3, peptidy vyznačené kurzívou, a obr. 4, peptidy v rámečcích). Protože fúzní partner DsbC překonal ostatní značky z hlediska výtěžku fúzního proteinu a obecné použitelnosti, byly tyto konstrukty vybrány pro studii optimalizace štěpení TEV. Jediným parametrem, který se ukázal jako kritický, a proto byl v tomto experimentu jemně doladěn, byla koncentrace DTT (0, 0,1, 0,5 a 2 mM DTT) přítomná ve štěpném pufru. Ačkoli totiž proteáza TEV vyžaduje pro optimální štěpení redukční podmínky, nadměrná koncentrace DTT by mohla vést k redukci vnitrodisulfidových můstků peptidů a ke ztrátě skládání a biologické aktivity.

Po 18hodinové inkubaci byla alikvotní část směsi TEV-fúzních peptidů okyselena. Frakce („před“ a „po“ štěpení TEV) byla vložena do přístroje Caliper za účelem stanovení účinnosti štěpení a vzorek byl analyzován na LC-MS za účelem kvantifikace toxinu a potvrzení jeho správného oxidačního stavu. Účinnost štěpení, hmotnostní analýza a výtěžky peptidů jsou shrnuty na obr. 5. Ke štěpení došlo za 32 podmínek testovaných v testu (v rozmezí od 30 do 100 % účinnosti). Podle očekávání nebylo štěpení úplné v nepřítomnosti DTT a úplné při nejvyšší koncentraci DTT. Z osmi peptidů bylo možné detekovat sedm oxidovaných v množství mg na litr kultury. Z 32 vzorků poskytlo 19 správnou oxidovanou hmotnost na LC-MS s různými výtěžky v závislosti na koncentraci DTT během štěpení. U zbývajících 13 vzorků nebyly na LC-MS detekovány žádné píky. Ze sedmi peptidů správně detekovaných při různých koncentracích DTT poskytly čtyři nejvyšší výtěžnost při 0,1 mM DTT, zatímco dva nepotřebovaly žádný DTT a jeden potřeboval k optimální výtěžnosti 0,5 mM DTT (obr. 5, tučně). Koncentrace DTT 0,1 mM se ukázala jako nejlepší kompromis, který bude zachován pro následující experimenty a výrobní postup projektu VENOMICS. Alikvoty 7 peptidů byly koncentrovány na 2 a 4 mg/ml a podrobeny stejnému experimentu s 0,1 mM DTT, aby se potvrdilo, že štěpení bude za těchto podmínek možné. V průměru účinnost klesla o 20 %, ale došlo k ní ve všech případech (údaje nejsou uvedeny).

Po optimalizaci podmínek štěpení bylo 96 purifikovaných fúzních proteinů (16 v 6 vektorech, viz Obr. 1, obr. 2, pozn. překl. 4) byly štěpeny v přítomnosti 0,1 mM DTT při koncentraci purifikovaných poolů (většinou v rozmezí 0,2 až 2 mg/ml) podle výše popsaného protokolu. Po štěpení a okyselení byl alikvot 96 vzorků analyzován pomocí LC-MS, aby se potvrdila správná molekulová hmotnost, výtěžek a oxidační stav konečného rekombinantního jedového peptidu. Při detekci mělo 96 rekombinantních peptidů molekulové hmotnosti v souladu s očekávanými hmotnostmi vzhledem k plně oxidovaným cysteinovým zbytkům (další podrobnosti o analýze hmotnostní spektrometrií viz doprovodný článek); redukované formy proteinů nebyly nikdy detekovány (údaje nejsou uvedeny), pravděpodobně v důsledku vysrážení nesprávně oxidovaných peptidů během štěpení a acidifikace. Konečný výtěžek pro 96 konstruktů, uvedený na obr. 6, byl vyjádřen jako absolutní konečný výtěžek peptidů v mg/l kultury nebo normalizovaný na 100 % pro každý peptid vzhledem k vektoru použitému pro expresi. Údaje (obr. 6) ukázaly, že všech 16 zkoumaných peptidů lze produkovat rekombinantně, ale v různém množství. Podobně jako u výtěžnosti získané pro fúzní varianty (obr. 4), obecný trend naznačuje, že kratší peptidy se produkují snadněji než delší. Konečný výtěžek jedového peptidu se značně lišil, přičemž rozdíl mezi nejhorším případem (0,3 mg/l, T10 u pHTP6) a nejlepším případem (17,6 mg/l, T1 u pHTP4) byl 50násobný. Soubor údajů také odhalil, že po štěpení fúzní značky došlo k výraznému poklesu výtěžku. To je pravděpodobně způsobeno drsnými podmínkami obnovy po štěpení (okyselení v 5% acetonitrilu, 0,1% kyselině mravenčí), kdy se na vrcholu proteázy TEV vysráží jakýkoli rozštěpený chybně složený peptid. Jak se dalo očekávat z výtěžků fúze, i když je výtěžnost vysoká, peptidy vyrobené pomocí pHTP1 poskytly celkově nejnižší množství peptidů (v průměru 0,4 mg/l, s maximem 1,9 mg/l pro T8). Naproti tomu peptidy vyrobené pomocí pHTP4 (DsbC) dosáhly nejlepších konečných výtěžků peptidů u 11 ze 16 peptidů a z nich (s výjimkou T11) byly výtěžky více než 2 mg/l pro každý peptid (průměrně 4,6 mg/l). Celkově fúze DsbC (buď pro periplasmatickou, nebo cytoplazmatickou expresi) úspěšně produkovaly 14 ze 16 jedových peptidů. Kromě toho bylo možné jeden peptid (T7) produkovat pouze v periplazmě pomocí fúzního partnera DsbC z vektoru pHTP4. U peptidů produkovaných přednostně z jiných vektorů (T10, 12, 13, 14, 16) výtěžky nepřesahují 2 mg/l, což zdůrazňuje robustní expresi z vektoru pHTP4. U těchto pěti peptidů bylo ve třech případech dosaženo nejvyšších výtěžků při cytoplazmatické expresi s fúzním partnerem DsbC, ve dvou případech následovala periplazmatická exprese s fúzním partnerem MBP. Ve většině případů (kromě T13,T14 a T16) překonala fúze exportovaná do periplazmy (buď pro DsbC, nebo MBP) svůj cytoplazmatický ekvivalent, což naznačuje, že alespoň část skládání může probíhat v periplazmě a část může probíhat ex vivo během purifikace. Pozoruhodným důkazem toho, že DsbC (a pravděpodobně i MBP) působí částečně jako pasivní rozpouštědlo uvnitř bakterie, je skutečnost, že zatímco výtěžky fúze mezi konstruktem DsbC a mutovaným DsbC byly u většiny peptidů velmi podobné (obr. 4), po štěpení a regeneraci je celkový výtěžek aktivního peptidu v případě redoxně aktivní fúze DsbC v průměru třikrát vyšší než u jeho mutovaného protějšku DsbC. Podrobnosti o kvantitativních hodnotách byly shrnuty v Doplňkovém souboru 7: Tabulka S7.

Podoba C-koncového (P1′) zbytku štěpného místa TEV nemá významný vliv na účinnost štěpení

N-konec některých jedových peptidů může přispívat k jejich vazbě na receptory. Je tedy možné, že zavedení jediného zbytku navíc na N-konci peptidu může ovlivnit jeho biologickou aktivitu . Kanonické rozpoznávací místo proteázy TEV vyžaduje na svém C-konci (pozice P1′) zbytek Gly nebo Ser, takže po odstranění značky zůstává na N-konci cílového peptidu nenativní zbytek Ser nebo Gly. Předchozí studie naznačila, že s výjimkou prolinu mohou být všechny postranní řetězce aminokyselin umístěny v poloze P1′ rozpoznávacího místa TEV proteázy s malým dopadem na účinnost zpracování. Analýza však byla provedena za optimálních podmínek TEV pufru. Aby byla výroba jedových peptidů časově efektivní, není možné do optimálních podmínek TEV zahrnout další kroky, jako je výměna pufru. Proto byla zkoumána schopnost TEV proteázy působit v elučním pufru IMAC (Tris 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, DTT 0,1 mM, pH8), který není optimálním pufrem pro TEV proteolýzu. Proteáza TEVSH použitá v této studii byla vybrána, protože ji lze snadno nadprodukovat a purifikovat v E. coli ve velmi vysokém množství (až 100 mg/l kultury). Specifičnost štěpení tohoto rekombinantního derivátu TEV proteázy však zůstává neznámá, zejména pokud různé aminokyseliny zaujímají pozici P1′ jejího rozpoznávacího místa (Dr. H. Berglund, osobní sdělení). Proto bylo za účelem prozkoumání aktivity této proteázy TEVSH za neoptimálních podmínek a při změně polohy P1′ rozpoznávacího místa proteázy vytvořeno 20 testovacích štěpných fúzních proteinových sekvencí. Každý fúzní protein obsahoval N-terminální značku 6HIS, vnitřní rozpoznávací sekvenci TEV, z nichž každá obsahovala jinou aminokyselinu v poloze P1´, fúzovanou C-terminálně se zkrácenou formou DNA/RNA-vazebného proteinu Kin17 z Homo sapiens. Proteiny byly přečištěny a podrobeny štěpení proteázou TEV za stejných podmínek, jaké byly použity ke štěpení 96 fúzních značek (viz výše). Údaje uvedené na obr. 7 potvrzují předchozí shromážděné údaje a naznačují, že s výjimkou prolinu (pravděpodobnost výskytu prolinu v poloze 1 jedových peptidů z přírodních zdrojů je nízká) lze všechny ostatní zbytky umístit v poloze P1′ rozpoznávacího místa proteázy TEV při zachování určité štěpné aktivity. Je však třeba vzít v úvahu peptidy s N-koncovým Trp, Thr, Leu, Glu, Arg, Asp, Val nebo Ile, u nichž účinnost štěpení klesá na 60 % nebo méně. V těchto případech může být nutné dosáhnout kompromisu mezi účinností štěpení/výtěžností produkce v závislosti na tom, jak dobře se peptid exprimuje.

Všimněte si, že na rozdíl od jedových peptidů neobsahuje Kin17 zbytky cysteinu. Úspěšnou výtěžnost štěpení v případě, že se v poloze 1 nachází cysteinový zbytek (86 %), získanou u Kin17, je tedy třeba potvrdit pro případy peptidů s cysteinem v poloze 1, který by se v nativním proteinu pravděpodobně podílel na disulfidovém můstku.