Klonování na bázi topizomerázy (TOPO klonování) je metoda klonování DNA, která nepoužívá restrikční enzymy ani ligázu a nevyžaduje žádné post-PCR postupy. Zní to jednoduše, že? Tato technika se opírá o základní schopnost komplementárních párů bází adeninu (A) a tyminu (T) hybridizovat a vytvářet vodíkové vazby. Tento příspěvek se zaměřuje na klonování TOPO s „lepivým koncem“ (nazývané také TOPO-TA); techniku klonování TOPO však lze přizpůsobit i pro klonování s tupým koncem.
Jak tedy klonování TOPO funguje?
Jak je znázorněno na obrázku níže, převis „A“ na modrém inzertu produktu PCR pochází z použití Taq polymerázy pro krok amplifikace, protože Taq polymeráza zanechává na 3′ koncích produktů PCR jediný deoxyadenosin (A). Komplementární „T“ v páru pochází z linearizované páteře topoizomerázy I. DNA topoizomeráza I (zobrazená jako zelený obláček) funguje jako restrikční endonukleáza i jako ligáza tím, že štěpí a znovu spojuje superzávitové konce DNA, aby usnadnila replikaci.
Technika TOPO specificky využívá topoizomerázu I izolovanou virem Vaccinia, protože tento enzym rozpoznává sekvenci DNA 5´-(C/T)CCTT-3′ a v této sekvenci tráví dvouvláknovou DNA. Energie z tohoto zlomu je uložena jako kovalentní vazba mezi odštěpeným 3´řetězcem DNA a tyrosylovým zbytkem topoizomerázy I (1). Pokud se objeví 5′ hydroxylová skupina z jiného vlákna DNA, může tuto kovalentní vazbu napadnout, čímž dojde ke spojení obou vláken DNA a uvolnění topoisomerázy (2).
V dnešní době komerčně dostupné soupravy TOPO poskytují vektory nebo klonovací ramena s převislými 3´ deoxythymidinovými (T) zbytky, které jsou kovalentně spojeny s epoizomerázou. Vektory v těchto soupravách mají také často místo pro topoizomerázu vložené do kazety s beta-galaktosidázou, což umožňuje výzkumníkovi provádět po transformaci modrobílý screening – samospojení konců vektorů vede k produkci modrých kolonií, které není třeba vybírat a sekvenovat pro potenciálně pozitivní klony. Jakmile zavedete svůj insert s 3′-koncovým převisem „A“, nastane kouzlo klonování TOPO.
Základní postup
Podívejme se na kroky potřebné pro klonování TOPO:
1. Klonování TOPO: Klonujte vektorový řetězec. Vytvořte si produkt PCR: Navrhněte standardní primery (není třeba přidávat jedinečná restrikční místa na koncích) a amplifikujte sekvenci vašeho zájmu pomocí polymerázy Taq pomocí vašeho oblíbeného protokolu PCR.
2. Nastavte klonovací reakci TOPO: Smíchejte produkt PCR a vektor TOPO.
3. Inkubujte 5 minut při pokojové teplotě: Reakci můžete umístit na led, pokud plánujete transformaci ihned, NEBO ji můžete přes noc uchovávat při -20C.
4. Transformujte klonovací reakci TOPO do kompetitivních buněk: Můžete k tomu použít svůj standardní laboratorní protokol; měli byste však zkrátit dobu inkubace na ledu na 5 minut (inkubace celých 30 minut výrazně nezlepší účinnost transformace).
5. Vyberte a analyzujte 10 bílých nebo světle modrých kolonií:
Pro tipy
- Nepřidávejte 5′ fosfáty do primerů PCR; potřebujete tuto volnou hydroxylovou skupinu!
- Možná budete chtít po posledním cyklu PCR zahrnout dodatečnou dobu prodlužování, abyste se ujistili, že se „A“ přidá ke všem produktům PCR.
- Mějte na paměti, že polymeráza Taq má chybovost přibližně 1 z 3 500 bází. Obvykle se místo Taq používají polymerázy s korektorovací funkcí, aby se snížila chybovost; korektorovací polymerázy však také odstraní všechny nespárované 3′ konce v produktu PCR. Pokud potřebujete snížit chybovost, použijte jednu z těchto metod, abyste zajistili, že si váš insert zachová 3′ A převis:
- Použijte směs korekturního enzymu a Taq, přičemž Taq použijte v nadměrném poměru 10:1.
- Gelově přečistěte svůj produkt PCR a inkubujte jej s pufrem, Taq a dATPs při 72C po dobu 10-15 min.
- Při míchání produktu PCR s vektorem TOPO můžete do reakce přidat další sůl:
Topoizomeráza I se z vektoru uvolní, když se produkt PCR a vektor ligují; může se však potenciálně znovu navázat a zkrátit nově ligovanou DNA. Sůl pomáhá zabránit opětovnému navázání topoizomerázy I, což vede k většímu počtu neporušených molekul. (Všimněte si, že množství přidané soli bude záviset na tom, zda plánujete transformaci do chemicky nebo elektrokompetentní E. coli – nadbytek soli způsobuje při elektroporaci oblouk, který by způsobil selhání elektroporace).
- Při inkubaci při pokojové teplotě se nedoporučuje překračovat časový limit 5 minut (při delší inkubaci byla zaznamenána nižší účinnost transformace); může však být nutné inkubovat 20-30 minut, pokud je koncentrace vašeho produktu PCR nízká nebo klonujete extrémně velký insert.
- Jelikož je standardní ligační reakce poměrně rychlá, ujistěte se, že máte pořádek a připravte si vše, co potřebujete pro další krok, než budete pokračovat.
- Předehřátí desky obsahující antibiotika před nanesením transformace vám může umožnit vidět kolonie do 8 hodin.
1. Při transformaci se můžete setkat s koloniemi. Shuman S. „Recombination mediated by vaccinia virus DNA topoisomerase I in Escherichia coli is sequence specific.“ (Rekombinace zprostředkovaná topoizomerázou I viru vakcíny v Escherichia coli je sekvenčně specifická). Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Nov 15;88(22):10104-8. PubMed PMID: 1658796. PubMed Central PMCID: PMC52876.
2. Nový přístup k molekulárnímu klonování a syntéze polynukleotidů pomocí vakcinální DNA topoizomerázy. Shuman S. J Biol Chem. 1994 Dec 23;269(51):32678-84. PubMed PMID: 7798275.
Další zdroje na blogu Addgene
- Provádějte místně řízenou mutagenezi pomocí PCR
- Použijte mutagenezi REPLACR ke snadnému generování inzercí a delecí v plazmidech
- Naučte se, jak ověřit svůj plazmid