Chromozomová analýza a CMA jsou klinicky užitečné diagnostické nástroje pro detekci chromozomálních abnormalit v celém lidském genomu. V současné době je CMA doporučována jako test první úrovně u mentálního postižení a vrozených vad, který nahradil dřívější roli chromozomové analýzy. V této studii jsme porovnali výsledky chromozomové analýzy a CMA u 3 710 případů, abychom určili hodnotu provádění chromozomové analýzy.
Maximální detekce mozaiky pomocí kombinace CMA a tradiční cytogenetické analýzy
Tato studie ukázala, že 1,2 % (43/3 710) pacientů mělo mozaikový nález. Mozaicismus byl zjištěn pouze chromozomovou analýzou u 39 % případů, a to z důvodu buď velmi nízkého (<10 %), nebo velmi vysokého (>80 %) procenta abnormálních buněk, zatímco 12 % případů bylo zjištěno pouze pomocí CMA. Zbývajících 49 % případů bylo detekováno jak pomocí CMA, tak pomocí chromozomové analýzy.
Detekce mozaicismu pomocí CMA a pomocí chromozomové analýzy se liší z důvodu rozdílné technologie a analyzované buněčné populace. CMA analyzuje DNA získanou ze všech nukleovaných buněk v periferní krvi včetně více buněčných linií. Naproti tomu chromozomová analýza se provádí především na T lymfocytech stimulovaných fytohemaglutininem. Studie prokázaly, že CMA může být citlivější, pokud abnormální buňky nereagují na mitogeny a/nebo jsou abnormality v T-buňkách vzácné nebo se nevyskytují, jako například u Pallister-Killiánova syndromu.5,6 Pět případů mozaikové trizomie, zahrnující chromozomy 8, 9, 14 a 22, bylo zjištěno pouze pomocí CMA.
Ačkoli CMA může snadno odhalit mozaiku na úrovni 30 % a více, je omezena v rutinním odhalování mozaiky na úrovni <10 %.6,13,14 Jiné maticové platformy, jako jsou například matrice jednonukleotidových polymorfismů, mohou být schopny lépe odhalit mozaicismus na základě informací získaných z frekvencí alel B.15,16 Chromozomová analýza může odhalit nízkoúrovňový mozaicismus prostřednictvím individuálního vyšetření velkého počtu buněk. Standardní chromozomové studie 20 buněk vyloučí 14% mozaicismus na 95% hladině spolehlivosti. Při identifikaci jedné nebo dvou abnormálních metafázních buněk lze vyšetřit více buněk. Analýza mnoha jednotlivých buněk je však časově a pracovně náročná. Pokud je podezření na mozaicismus nebo je potvrzen, lze využít metodu FISH k vyšetření stovek jednotlivých interfázních buněk za účelem stanovení úrovně mozaicismu; metoda FISH je relativně méně časově náročná než analýza chromozomů.
Anormality přehlédnuté pomocí CMA, s výjimkou zjevně vyvážených přestaveb, představují <0,2 % všech případů v této studii ( tabulka 2 ). Většina případů byla nezjistitelná pomocí CMA, protože podíl abnormálních buněk byl pod detekčním limitem CMA (<10 %). Klinický význam velmi nízké úrovně mozaicismu v případech 2 a 3 a malého markerového chromozomu, který obsahuje výhradně pericentromerické opakované sekvence v případě 4, je nejasný. Zbývající abnormality přehlédnuté pomocí CMA jsou spojeny s fenotypovými abnormalitami. Není jasné, proč byla abnormalita pozorovaná u 30 % kultivovaných buněk v případě 5 přehlédnuta metodou CMA, ale pravděpodobně je to způsobeno nadměrným zastoupením abnormálních buněk právě v T-buňkách. Přítomnost dvou různých buněčných linií s genomickými zisky a ztrátami zahrnujícími stejnou oblast vedla k čisté genomické rovnováze pro tuto oblast, čímž unikla detekci pomocí CMA, jak ukazuje případ 6.
Detekce mozaicismu pomocí CMA se opírá o odchylku od očekávaných logaritmických poměrů pro deleci nebo duplikaci bez mozaicismu. Podezření na mozaicismus musí být potvrzeno analýzou chromozomů na kultivovaných buňkách nebo analýzou FISH, nejlépe pomocí krevních nátěrů. V 11 zde studovaných případech byla CMA schopna odhalit chromozomovou abnormalitu, ale nedokázala odhalit, že se jedná o mozaiku, a to z důvodu nízkého procenta normálních buněk nebo přítomnosti izodicentrického chromozomu vedoucího k segmentální tetrasomii. Například u dvou případů bylo pomocí CMA zjištěno zvýšení počtu kopií všemi sondami pro chromozom 18 ( obrázek 2 ), což naznačuje trizomii 18. Ve skutečnosti analýza chromozomů ukázala, že jeden případ měl trizomii 18 ve všech buňkách ( obrázek 2a ), zatímco druhý případ měl mozaiku pro trizomii 18 v 80 % buněk ( obrázek 2b ). Kromě toho, pokud dvě nebo více abnormálních buněčných linií zahrnují stejnou oblast, jako je tomu v případě na obrázku 2c , je pro správnou interpretaci chromozomových abnormalit nezbytná chromozomová analýza a/nebo analýza FISH.
Chromozomální strukturální informace poskytuje chromozomová analýza, ale není zřejmá z CMA
CMA poskytuje velmi spolehlivé informace o tom, zda jsou přítomny zisky a ztráty počtu kopií, ale neposkytuje informace o poloze nebo orientaci. Naše studie ukázaly, že strukturální abnormality byly pozorovány v 18 % abnormálních případů CMA. Polovina strukturálních přestaveb zjištěných v této studii jsou nebalancované translokace/inzerce, jedna třetina jsou jiné strukturální změny, jako jsou prstencové chromozomy, markerové chromozomy, izochromozomy a izodicentrické chromozomy, a zbývajících 15 % jsou komplexní přestavby. Vzhledem k tomu, že většina těchto strukturních aberací zahrnuje subtelomerické oblasti, je u terminálních změn počtu kopií vyšší pravděpodobnost dalších strukturních abnormalit.17 Obecně lze říci, že jak chromozomová analýza, tak analýza FISH jsou schopny identifikovat translokace, inzerce, izochromozomy a markery, přičemž každá metoda má jinou sílu. Ačkoli FISH může odhalit změny příliš malé na to, aby byly zjistitelné chromozomovou analýzou, analýza vzorů chromozomových pásů poskytuje další informace o dotčených oblastech. V případě komplexních přestaveb může být pro úplné určení komplexních strukturálních změn nutná kombinace FISH a chromozomové analýzy. Až na tuto výjimku je analýza FISH po abnormálním nálezu pomocí CMA obvykle dostačující k poskytnutí informací o povaze změny počtu kopií.
Některé chromozomální přestavby mohou být přehlédnuty i po provedení CMA i FISH. Například v případě 9 byla pomocí CMA zjištěna intersticiální delece v oblasti 2q ( obrázek 1a ). Bez chromozomové analýzy se přestavba jeví jako prostá jednoduchá delece i po potvrzující analýze FISH. Vyšetření karyotypu však ukázalo abnormální chromozom 2 s vložením úseku z 17q23.1q23.3 do pásma 2p11.2. V případě, že by se jednalo o chromozom 2, bylo by možné jej označit za chromozom 2. Kromě toho má chromozom 2 s vloženým segmentem 17q také pericentrickou inverzi mezi 2p12 a 2q31.1. K deleci na 2q31.1 zjištěné pomocí CMA došlo s největší pravděpodobností v inverzním zlomu na dlouhém raménku jednoho chromozomu 2 nebo v jeho blízkosti. Souhrnně lze říci, že případ 9 měl komplexní přestavbu zahrnující deleci na 2q detekovatelnou pomocí CMA, ale nezjistitelnou pomocí chromozomové analýzy, a také inverzi a inverzi zahrnující chromozomy 2 a 17, detekovatelné pomocí chromozomové analýzy, ale nikoli pomocí CMA. Podobně případ 10 měl de novo přestavby zahrnující čtyři chromozomy, včetně inzerce úseku 2q14.2q24.1 do krátkého raménka jednoho chromozomu 6, který má také paracentrickou inverzi, a reciproční translokaci mezi chromozomy 12 a 18. Ztráty počtu kopií byly identifikovány pomocí CMA v blízkosti zlomových bodů na chromozomech 2 a 6 ( obrázek 1b ). Správná diagnóza vyžaduje kombinaci CMA a chromozomové analýzy.18
Identifikace chromozomálních strukturálních přestaveb je nezbytná pro genetické poradenství rodině. Genomové nerovnováhy zjištěné pomocí CMA mohou být způsobeny nevyváženým segregačním produktem balancované translokace nebo inzerce u jednoho z rodičů, a proto opravňují k důraznému doporučení provést rodičovské studie. Kromě toho informace o chromozomální struktuře poskytují vodítko pro to, které rodičovské studie by měly být doporučeny. U přestaveb, které jsou pravděpodobně produkty balancované přestavby, by měla být místo rodičovské CMA provedena rodičovská FISH nebo chromozomová analýza.
Zřejmě balancované přestavby s normální studií CMA
V této studii byly ve 30 případech (~0,8 %) chromozomovou analýzou zjištěny jednotlivé zřejmě balancované translokace nebo inverze bez dalších chromozomových abnormalit. Bylo zjištěno, že ~40 % pacientů s mnohočetnými vrozenými anomáliemi/mentální retardací a de novo zjevně vyváženou translokací má kryptické abnormality v blízkosti zlomových bodů nebo nesouvisející se zlomovými body, které lze snadno detekovat pomocí CMA.19,20 CMA však v těchto 30 případech nezjistila žádné změny počtu kopií v blízkosti zlomových bodů. K tomuto pozorování může přispívat několik faktorů. Většina přestaveb byla zděděna na základě rodičovských studií podskupiny případů, což znamená, že je pravděpodobnější, že jsou „skutečně“ vyvážené. Kromě toho byly do této studie zahrnuty robertsonovské translokace, které obvykle nevedou ke změnám počtu kopií euchromatinu, ale v publikovaných studiích byly vyloučeny. Navíc mohou být přehlédnuty malé kryptické delece/duplikace sousedící s body zlomu, protože matrice použité pro většinu těchto případů byly cílené a neměly dostatečné genomické rozlišení pro detekci nerovnováhy.
Ačkoli většina vyvážených přestaveb je benigní, přestavby de novo jsou spojeny s vyšším rizikem onemocnění v důsledku kryptické delece nebo duplikace, narušení genu nebo enhanceru, vlivu polohy nebo epigenetického účinku. Riziko výskytu závažné vrozené anomálie u de novo reciprokých translokací a inverzí je 6,7 %.21 Očekává se, že riziko bude nižší u případů s normální CMA při použití celogenomové array. Proto je méně pravděpodobné, že jednoduché balancované přestavby zjištěné v této studii jsou příčinou fenotypů pacientů.
Strategie založená na důkazech pro účinnou detekci chromozomových abnormalit
Abychom určili, zda a kdy by měla být provedena chromozomová analýza pro klinickou diagnózu chromozomových abnormalit, zkoumali jsme výsledky případů studovaných současně pomocí CMA i chromozomové analýzy. Chromozomální abnormality zjištěné chromozomovou analýzou, ale zcela přehlédnuté CMA, byly pozorovány v ~1 % případů, včetně zjevně vyvážených přestaveb v 0,8 % případů a nerovnováh spojených s mozaikou v 0,16 % případů. Chromozomová analýza navíc usnadnila detekci chromozomálních strukturálních přestaveb v 18 % případů s abnormálními výsledky CMA.
Ačkoli CMA poskytuje informace o změnách počtu kopií a mozaicismu, pouze chromozomová analýza nebo FISH poskytuje informace o chromozomální struktuře spojené s těmito změnami počtu kopií a identifikuje některé případy mozaicismu, které nebyly detekovány pomocí CMA. Výhodou FISH oproti chromozomové analýze je, že lze detekovat malé (<3-10 Mb) změny počtu kopií a rychle analyzovat velký počet jader, což je užitečné zejména pro hodnocení mozaicismu. Proto lze po abnormální CMA nejprve použít analýzu FISH k detekci strukturálních přestaveb spojených se změnami počtu kopií a k potvrzení mozaicismu a určení procenta abnormálních buněk. Pokud jsou pomocí FISH zjištěny inzerce nebo translokace, může být indikována chromozomová analýza k určení dotčených chromozomů. Místo standardní chromozomové analýzy, při níž se studuje 20 metafázních buněk ze dvou kultur, postačí pro tento účel malá chromozomová analýza pěti buněk z jedné kultury. Tato strategie by odhalila všechny strukturální změny s výjimkou několika vzácných komplexních přestaveb.
U případů s normálním výsledkem CMA lze zvážit provedení úplné chromozomové analýzy, pokud má pacient mnohočetné vrozené anomálie, dysmorfní rysy a/nebo mentální retardaci připomínající chromozomální syndrom nebo klinické projevy svědčící o možném mozaicismu, jako jsou pigmentové abnormality, které jsou náhodně rozmístěné nebo které sledují linie Blashko, a asymetrie růstu ve spojení s mentálním postižením. Na základě této studie by ~1 % případů mělo informativní výsledky chromozomální analýzy, ale <0,001 případů (3/3 710) by mělo klinicky významný nález.
V souhrnu naše studie dále potvrzuje, že téměř všechny chromozomální abnormality zjistitelné chromozomální analýzou jsou detekovány pomocí CMA, což podporuje doporučení, aby CMA byla testem první úrovně. Tradiční cytogenetická analýza však zůstává užitečná pro detekci mozaiky a charakterizaci strukturálních přestaveb.